程如玉，韓 瑞，王尚華，丁 翔，丁丹丹，馮振中，徐錦程

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)簡稱口腔鱗癌，是頜面部最常見的惡性腫瘤之一，其侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者5年生存率較低的主要原因[1-2]。大量研究[3-4]表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)不僅參與正常胚胎的發(fā)育和生成，而且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)作為Hippo信號(hào)通路中起中心作用的開關(guān)蛋白，在細(xì)胞的正常發(fā)育過程中結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TEAD促進(jìn)下游基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖生長。雖然YAP在多數(shù)腫瘤中扮演著促癌基因的角色，但在某些情況下，其促調(diào)亡作用致使YAP作為促癌基因遭到質(zhì)疑。YAP是否通過促進(jìn)EMT進(jìn)程，在OSCC侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，目前尚無相關(guān)報(bào)道。該研究旨在通過檢測YAP和EMT相關(guān)蛋白E-cadherin和Vimentin在OSCC中的表達(dá)情況，進(jìn)而探究其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以期為OSCC相關(guān)機(jī)制研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本選擇 收集蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科2013年1月～2016年12月手術(shù)切除的經(jīng)病理科完好存檔的OSCC石蠟組織標(biāo)本54例。要求原發(fā)部位在口腔，術(shù)前未行放療、化療及其他影響腫瘤的治療，術(shù)后病理證實(shí)為OSCC。同時(shí)選擇癌旁正常上皮組織標(biāo)本(經(jīng)擴(kuò)大切除，距離癌組織邊緣3 cm以上)54例作為對照組。

1.1.2病例資料 男34例，女20例；年齡28～77歲，中位年齡52歲；高分化18例，中分化18例，低分化18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；舌癌24例，唇癌14例，牙齦癌10例，口底癌6例；根據(jù)WHO臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期24例，Ⅱ期9例，Ⅲ期7例，Ⅳ期14例。本研究涉及的組織標(biāo)本經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.1.3主要試劑 兔抗人YAP多克隆抗體(ABP52720)購自武漢艾美捷科技有限公司;兔抗人 E-cadherin和Vimentin單克隆抗體(MAB-0589、MAB-0735)、即用型免疫組化 EliVisionTMplus試劑盒(KIT-9901)、DAB顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法所有組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4～5 μm連續(xù)切片后，具體染色步驟嚴(yán)格按照 EliVisionTMplus/HRP免疫組化說明書進(jìn)行。一抗YAP、E-cadherin及Vimentin稀釋比例均為1 ∶300。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。

1.3結(jié)果判定每張組織切片由2名病理科高年資醫(yī)師在雙盲下閱片。顯微鏡高倍視野下(×400)隨機(jī)選擇具有代表性的5個(gè)視野，根據(jù)周榕 等[5]、陳穎 等[6]判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分：① 染色程度:無著色，0分；淡黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分；② 陽性染色細(xì)胞百分比:< 5 %，0分；6%～25 %，1分；26 %～50%，2分；>50 %，3分?？傇u分按①×②計(jì)算，總分<3分記為陰性反應(yīng)(-)，≥ 3分為陽性反應(yīng)(+)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分析YAP、E-cadherin及Vimentin的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1YAP、E-cadherin和Vimentin在OSCC和癌旁組織中的表達(dá)YAP陽性染色主要定位于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)，E-cadherin陽性染色主要定位于細(xì)胞膜，Vimentin陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)。三者在OSCC和癌旁組織中的陽性表達(dá)率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖1、表1。

2.2YAP、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)與OSCC臨床參數(shù)的關(guān)系YAP的表達(dá)與OSCC的分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與臨床分期、性別、年齡、發(fā)病部位均無關(guān)(P>0.05)。E-cadherin和Vimentin的表達(dá)與OSCC臨床分期、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與患者性別、年齡、發(fā)病部位均無關(guān)(P>0.05),見表2。

2.3YAP、E-cadherin和Vimentin在OSCC中表達(dá)的相關(guān)性相關(guān)性分析顯示，YAP的表達(dá)與 E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.424,P=0.002)，與Vimentin表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.519,P=0.001)，見表3。

圖1 OSCC和癌旁組織中YAP、E-cadherin和Vimentin的表達(dá) SP×400

A、B：YAP在OSCC及癌旁組織中的表達(dá)；C、D：E-cadherin在OSCC及癌旁組織中的表達(dá)；E、F：Vimentin在OSCC及癌旁組織中的表達(dá)

表1 YAP、E-cadherin及Vimentin在OSCC和癌旁組織中的表達(dá)[n(%)]

表2 YAP、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)與OSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 [n(%)]

表3 OSCC組織中YAP、E-cadherin和Vimentin的相關(guān)性分析(n)

3 討論

EMT是指上皮樣細(xì)胞表型在某些誘導(dǎo)因素的作用下向間質(zhì)樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程。研究[7-8]表明EMT是癌細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的首要環(huán)節(jié)。細(xì)胞經(jīng)歷EMT后表現(xiàn)出多種上皮標(biāo)志物的表達(dá)下調(diào)和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)，其中以E-cadherin和Vimentin最為典型。E-cadherin僅在上皮細(xì)胞中表達(dá)，具有維持細(xì)胞極性、構(gòu)建與相鄰細(xì)胞及外基質(zhì)間黏附連接的作用，其表達(dá)減少是癌癥進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的前提條件。Vimentin穩(wěn)定表達(dá)于間葉細(xì)胞，作用與E-cadherin相反，其出現(xiàn)預(yù)示著癌細(xì)胞發(fā)生了間葉表型轉(zhuǎn)變。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin在OSCC中的表達(dá)較癌旁組織明顯降低，在高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高表達(dá)，在中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組低表達(dá)；而Vimentin在OSCC中的表達(dá)較癌旁組織明顯增高，在高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組低表達(dá)，在中低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高表達(dá)。表明隨著OSCC惡性程度的提高，癌細(xì)胞獲得EMT表型,發(fā)生了EMT現(xiàn)象。

Hippo信號(hào)通路是高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，YAP作為其下游的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用[9]。本研究結(jié)果顯示：YAP在OSCC中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，YAP的陽性率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級亦有相關(guān)性，與Yoshikawa et al[10]的研究結(jié)果基本相符。但與之相悖的是，YAP的陽性率與臨床分期無關(guān)，這可能與樣本量較少有關(guān)，有擴(kuò)大樣本量乃至更深一步研究的必要。除此之外，本研究結(jié)果還表明：高分化OSCC中YAP多單獨(dú)表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而中低分化OSCC中YAP可在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均表達(dá)。這一現(xiàn)象表明：不同分化的OSCC細(xì)胞內(nèi)已發(fā)生分子生物學(xué)變化，而YAP可能在其中起到了重要的作用。故細(xì)胞核YAP的高表達(dá)或許可作為評判OSCC進(jìn)展及預(yù)后不良的指標(biāo)之一。

有文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道，YAP對EMT起到潛在的誘導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示，YAP的高表達(dá)伴隨著E-cadherin表達(dá)的下調(diào)和Vimentin表達(dá)的上調(diào)，即YAP在OSCC中與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，與Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)性。這在一定程度上也表明了YAP可能作為誘導(dǎo)基因之一促進(jìn)了EMT進(jìn)程。其可能機(jī)制是YAP作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過與Smad蛋白家族結(jié)合，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的活性，TGF-β合成和釋放增加，導(dǎo)致細(xì)胞脫黏附、運(yùn)動(dòng)遷徙能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)OSCC的侵襲和轉(zhuǎn)移。