吳丹丹，彭麗朵，喬金平，徐元宏

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種雙鏈DNA病毒，已鑒定的型別超過200種。HPV依據(jù)其引發(fā)疾病的惡性程度，分為高危型和低危型，低危型主要引起皮膚疣等良性病變，以6、11型最為多見[1]；而高危型的持續(xù)感染在宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變、宮頸小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌等腫瘤的發(fā)展中起到了關(guān)鍵的作用[2-3]。

HPV在世界范圍內(nèi)的感染具有普遍性，不同國家及地區(qū)的亞型分布各不相同[3-5]。高危型在西方國家主要以16、18型最為常見，亞洲國家則以16、18、52和58型常見。目前接種HPV疫苗是一種有效降低患宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的方式，國外已上市的疫苗有二價(jià)、四價(jià)和九價(jià)3種，國產(chǎn)的疫苗尚未上市，目前已鑒定的高危型有10余種型別[6]。該研究通過對合肥地區(qū)常規(guī)體檢女性的宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行HPV 基因分型檢測，分析普通體檢人群HPV特別是高危型的感染情況和基因型分布特點(diǎn)，以期為合肥地區(qū)人群在HPV疫苗的選擇上提供指導(dǎo)，同時(shí)也為針對我國人群感染特點(diǎn)的國產(chǎn)HPV疫苗的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1研究對象 選取2016年1月1日～2017年12月31日在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心常規(guī)體檢的2 558位女性，年齡22～84(42.55±9.99)歲。

1.1.2標(biāo)本采集與保存 以無菌拭子采集宮頸分泌物，將拭子頭部放入脫落細(xì)胞保存液中，2 h內(nèi)送檢。采集的標(biāo)本若不能及時(shí)前處理，應(yīng)置于-20 ℃ 保存。

1.1.3試劑與儀器 HPV27型核酸分型檢測試劑盒(流式熒光法，包括核酸擴(kuò)增組份、雜交組份、脫落細(xì)胞保存液、核酸提取試劑)、基因擴(kuò)增儀購自上海透景公司；金屬浴、冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；Luminex200 多功能流式點(diǎn)陣儀購自美國Luminex公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1核酸提取 將采集好的標(biāo)本渦旋混勻，取200 μl標(biāo)本至1.5 ml離心管，12 000 r/min離心1 min，棄上清液，向沉淀物中加入200 μl核酸提取試劑，渦旋混勻，100 ℃ 煮沸15 min，15 000 r/min離心5 min，即可得到熱裂解法提取的核酸，所得核酸將用于下一步實(shí)驗(yàn)或于-20 ℃ 中保存待用。

1.2.2多重PCR 依據(jù)說明書進(jìn)行多重PCR。PCR反應(yīng)體系含引物混合液5 μl、PCR預(yù)混液10 μl、Taq酶0.8 μl和DNA模板5 μl。 反應(yīng)條件為95 ℃、5 min; 95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s,5個(gè)循環(huán);95 ℃ 、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s, 35個(gè)循環(huán);72 ℃、 3 min，4 ℃ 維持，即可得到擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。

1.2.3雜交和上機(jī)檢測 依據(jù)說明書進(jìn)行微球與PCR產(chǎn)物的雜交。反應(yīng)體系為微球雜交液22 μl，PCR產(chǎn)物3 μl。反應(yīng)條件為95 ℃、5 min,48 ℃、 30 min。此步反應(yīng)完成后，加入75 μl 鏈霉親和素-藻紅蛋白(SA-PE)，48 ℃、 15 min，即可得到雜交產(chǎn)物。再使用Luminex 200(需48 ℃ 預(yù)熱)進(jìn)行雜交產(chǎn)物的檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行分析，資料以頻數(shù)及頻率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HPV感染率檢測2 558例常規(guī)體檢標(biāo)本，主要人群分布為22～84歲女性。其中陽性樣本397例，陽性率為15.52% (397/2 558)，樣本被分為4個(gè)年齡段，結(jié)果見表1。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，各年齡段之間，總陽性率(χ2=3.624，P=0.305)，高危型陽性率(χ2=1.975，P=0.578)，低危型陽性率(χ2=4.507，P=0.212)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同年齡段單重感染和多重感染分布情況見表2，各年齡段的感染率隨同時(shí)感染型別的個(gè)數(shù)增加而減少，以單一感染最高 (12.28%)，五重感染最低 (0.04%)。

表1 HPV感染與年齡分布

1部分體檢者為多重感染，故高危型例數(shù)與低危型例數(shù)之和大于陽性人數(shù)

表2 HPV單一感染與多重感染在不同年齡段分布情況 [n(%)]

1該陽性率為此感染人數(shù)與該年齡段檢測總?cè)藬?shù)比值

觀察各感染組年齡分布，單重、二重、四重感染的感染高峰年齡均為>50歲組，而三重和五重的感染高峰年齡為21～30歲組。

2.2HPV27種亞型感染率2 558例標(biāo)本中共檢測出26種型別(除26型外)。低危型別的檢出率為6.61% (169/2 558)，高危型別為13.02% (333/2 558)。高危型和低危型所占總陽性型別例數(shù)的比例分別為66.33% (333/502)和33.67% (169/502)。由表3可知，高危型中52 (9.76%)、16 (9.16%)、58 (6.77%)和53 (5.98%)為優(yōu)勢亞型；低危型中，61 (6.77%)、81 (5.78%)、55 (5.38%)和43 (4.98%)為優(yōu)勢亞型。

表3 合肥地區(qū)女性HPV各亞型陽性分布比例

1部分體檢者為多重感染，故HPV型別例數(shù) (502)之和大于陽性人數(shù) (393)

表4為不同年齡優(yōu)勢亞型的分布情況，21～30歲組中，16、43和52等亞型常見，31～40歲組以16、52、61和58亞型常見，41～50歲組以 16、52、53和58亞型常見，大于50歲組以52、61和53亞型常見。據(jù)表中數(shù)據(jù)可推斷，30歲以下女性主要感染亞型為16；30～50歲女性16和52均為最常見亞型；而50歲以上女性，則以52為主要感染亞型。

表4 不同年齡組HPV感染的優(yōu)勢亞型分布

3 討論

宮頸癌是女性好發(fā)的第二位惡性腫瘤，研究[3]表明高危型可直接引起浸潤性宮頸癌。HPV基因型分布受種族和地區(qū)的影響較大，進(jìn)行不同地區(qū)的HPV年齡和亞型分布研究對HPV的流行病學(xué)及疫苗接種有重要意義。現(xiàn)有的合肥地區(qū)的HPV感染分布資料主要以門診及住院就診患者為主，且樣本量較低，反映普通人群中的分布情況有所欠缺。而多數(shù)HPV感染是亞臨床和隱匿性的，本研究對象為常規(guī)體檢人群，主要探討合肥地區(qū)的HPV亞型分布和年齡分布。結(jié)果顯示合肥地區(qū)HPV基因亞型中陽性比例最高的高危型分別是52 (9.76%)、16 (9.16%)、58 (6.77%)和53型 (5.98%)，比例最高的低危型分別是61 (6.77%)、81 (5.78%)、55 (5.38%)和43 (4.98%)型。感染的總陽性率隨年齡段依次遞增，且以一種或兩種型別感染最為常見。

與其他地區(qū)相比，合肥地區(qū)的感染既有相似點(diǎn)也有不同點(diǎn)。其一，高危型感染率較高的基因型別與國內(nèi)大部分地區(qū)相同，主要以16、52和58型最為多見[7]。低危型別中，合肥地區(qū)以61型 (6.77%)陽性率最高，這個(gè)和成都地區(qū)相似[8]，而其他地區(qū)的研究由于使用的分型試劑盒不包括61型，所以其他地區(qū)缺乏此型別的數(shù)據(jù)。本研究數(shù)據(jù)顯示，合肥地區(qū)16型(1.94%)的感染偏向20～30歲女性，>50歲女性則主要以52型(2.17%)感染為主；而30～50歲女性人群中16型和52型陽性率相同 (1.95%，33/1 690)，而現(xiàn)有研究[9]表明52型亦可引起宮內(nèi)病變，如子宮內(nèi)膜癌和子宮肌瘤等；因此本地區(qū)30歲以上女性在患有相關(guān)疾病時(shí)應(yīng)注意檢查是否有52型的感染；反之亦然，對確定有52型感染的女性，也應(yīng)注意是否患有相關(guān)疾病。其二，HPV的年齡分布，其他地區(qū)感染陽性率大多有兩個(gè)年齡高峰[ (南京，30～39歲、50～59歲)、 (蘇州，<20歲、>50歲)、 (珠海，<21歲、>50歲)][10-12]，而本研究HPV常規(guī)體檢人群缺乏22歲及以下人群的數(shù)據(jù)，所以可能缺乏第一個(gè)年齡高峰的數(shù)據(jù)。而在22歲以上人群中，合肥地區(qū)女性HPV感染陽性率隨著年齡增長而增高，>50歲為感染高峰年齡，這一點(diǎn)和其他地區(qū)是相似的。50歲以上女性可能因其處于絕經(jīng)后雌激素水平紊亂和免疫力下降的階段，更容易被HPV病毒感染[10]，從而呈現(xiàn)較高的感染率，因此，本地區(qū)50歲以上女性更需要重視HPV感染和宮頸癌的篩查。

由于缺少抗HPV病毒的有效藥物，HPV更多依靠接種疫苗來預(yù)防感染。國際上現(xiàn)有的HPV疫苗主要有3種類型：二價(jià) (16、18)、四價(jià) (6、11、16、18)和九價(jià) (6、11、16、18、31、3、45、52、58)[6]。國內(nèi)已引進(jìn)的二價(jià)及四價(jià)疫苗并未覆蓋亞洲地區(qū)高發(fā)的52和58兩型，而合肥地區(qū)更是以52型為高感染率型別，大多數(shù)年齡段的女性都被發(fā)現(xiàn)有此型別的感染。因此覆蓋了52、58型的九價(jià)疫苗可能更適合本地區(qū)未感染HPV病毒的女性人群；雖然有報(bào)道[13]稱二價(jià)疫苗在避免16、18型感染的同時(shí)，還可為31、45型提供有限的交叉保護(hù)。

綜上所述，本研究通過統(tǒng)計(jì)分析合肥地區(qū)體檢女性人群的HPV感染及基因型別分布特點(diǎn)，對研究HPV感染的流行病學(xué)和宮頸癌的預(yù)防等提供一定的理論依據(jù)，尤其對本地區(qū)女性人群HPV疫苗接種有一定的指導(dǎo)意義。