朱正春，姚夢群，嚴(yán)芳莉，仲 飛,，3

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是臨床上常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均逐年上升，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。早期肝癌患者的治療仍以手術(shù)為最佳治療手段，但絕大多數(shù)患者在確診時(shí)已失去了手術(shù)的機(jī)會，多依賴于化學(xué)藥物的治療，然而，化療對肝癌患者具有較大的副作用，因此開發(fā)新型的抗腫瘤藥物對于臨床具有積極的意義[1-2]。西黃丸由牛黃、麝香、乳香及沒藥組成，具有消腫止痛、解毒散癰、軟堅(jiān)散結(jié)之效，是臨床上治療“肺癰”、“痰核”、“瘰疬”及“乳巖”之名方。據(jù)報(bào)道，異常激活的STAT3信號通路與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等均密切相關(guān)[3-5]。該研究將考察西黃丸對肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及STAT3異常激活的抑制效果。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器西黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z11020073，規(guī)格：3 g/瓶)；人肝癌細(xì)胞株HepG2(美國ATCC公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號：Forma 370，美國Thermo公司)；MTT試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清及胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；倒置相差顯微鏡(日本尼康公司)；鼠抗人STAT3及p-STAT3單克隆抗體及GAPDH內(nèi)參(美國Sigma公司)；Transwell小室(美國Millipore公司);PCR儀(型號：MyCycler)、蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)移儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2方法

1.2.1分組 采用相同的人肝癌細(xì)胞株HepG2作為研究對象，依據(jù)外源性給予的西黃丸含藥血清濃度不同分為西黃丸低劑量組(4 mg/ml)、西黃丸中劑量組(8 mg/ml)及西黃丸高劑量組(16 mg/ml)。

1.2.2西黃丸含藥血清的制備 首先利用研缽將西黃丸研磨呈細(xì)粉，并以預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基浸泡于密閉的容器內(nèi)48 h(生藥量為100 mg/ml)，超聲震蕩2 h助溶，然后提取上清液，過濾膜(0.22 μm)，然后調(diào)整至所需濃度[6]。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2用含有10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4MTT檢測西黃丸對肝癌細(xì)胞的增殖作用 以1×105個(gè)/ml的密度將HepG2細(xì)胞株接種于96孔培養(yǎng)板中，對照組加入100 μl的DMEM培養(yǎng)基，藥物組設(shè)置3個(gè)濃度，分別是西黃丸低劑量組(4 mg/ml)、西黃丸中劑量組(8 mg/ml)及西黃丸高劑量組(16 mg/ml)，每個(gè)組別設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別作用24、48、72 h，避光加入終濃度為0.5 mg/ml的MTT溶液100 μl，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄掉上清液，加入DMSO 150 μl，搖床震蕩10 s，使用酶標(biāo)儀于490 nm處測定各酶標(biāo)孔的吸光度值，并計(jì)算抑制率，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組)×100%。

1.2.5Transwell小室檢測 將HepG2肝癌細(xì)胞接種于Transwell小室內(nèi)，加入不同濃度的西黃丸，于下室內(nèi)加入培養(yǎng)基，孵育48 h，固定細(xì)胞，進(jìn)行DAPI染色。

1.2.6RT-PCR RT-PCR法測定基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)，各組作用細(xì)胞48 h后，采用TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄按照Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit試劑盒進(jìn)行，以GAPDH作為內(nèi)參，擴(kuò)增后，以2-ΔΔCt方法計(jì)算MMP-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)。RT-PCR引物序列：MMP-2：上游引物：5′-GGCACCCATTTACACCTACA-3′，下游引物：5′-CCAAGGTCAATGTCAGGAGAG-3′；MMP-9：上游引物：5′-GAACTTTGACAGCGACAAGAAG-3′，下游引物：5′-CGGCACTGAGGAATGATCTAA-3′；GAPDH：上游引物：5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA-3′，下游引物：5′-GAGTCCTTCCACGATACCAAAG-3′。

1.2.7Western blot 各劑量的西黃丸作用于肝癌細(xì)胞48 h，裂解細(xì)胞，提取蛋白，然后加入到SDS-PAGE蛋白凝膠上樣孔內(nèi)，120 V電泳30 min，之后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，分別加入一抗p-STAT3(1 ∶500)、STAT3(1 ∶500)，4 ℃搖床過夜，加入二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育1 h，曝光，以目的蛋白的條帶與對應(yīng)內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1西黃丸對肝癌細(xì)胞增殖作用的抑制率與作用24 h比較，作用48 h及72 h的相同濃度西黃丸對肝癌細(xì)胞的抑制作用顯著增強(qiáng)，呈時(shí)間依賴性(P<0.05)，與西黃丸低劑量組比較，西黃丸中及高劑量組肝癌細(xì)胞的抑制作用顯著增強(qiáng)，呈劑量依賴性(P<0.05)，見表1。

表1 西黃丸對肝癌細(xì)胞增殖作用的抑制率

與西黃丸低劑量組比較：*P<0.05；與24 h作用時(shí)間比較：#P<0.05

2.2不同濃度的西黃丸對肝癌細(xì)胞侵襲作用的影響與對照組比較，西黃丸低、中及高劑量組肝癌細(xì)胞的侵襲作用均顯著減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 不同濃度的西黃丸對肝癌細(xì)胞侵襲作用的影響

1：對照組；2：西黃丸低劑量組；3：西黃丸中劑量組；4：西黃丸高劑量組；與對照組比較：*P<0.05

2.3不同濃度的西黃丸對肝癌細(xì)胞侵襲作用的影響

2.3.1不同濃度的西黃丸對肝癌細(xì)胞MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表達(dá)的影響 與對照組比較，西黃丸低、中、高劑量組的MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；與西黃丸低劑量組比較，中、高劑量組的MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；與西黃丸中劑量組比較，高劑量組的MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見表2。具體擴(kuò)增曲線見圖2。

表2 不同濃度的西黃丸對肝癌細(xì)胞MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較：*P<0.05；與西黃丸低劑量組比較：#P<0.05；與西黃丸中劑量組比較：△P<0.05

圖2 MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的RT-PCR擴(kuò)增曲線

A：MMP-2 mRNA的RT-PCR擴(kuò)增曲線； B：MMP-9 mRNA的RT-PCR擴(kuò)增曲線

2.3.2不同濃度的西黃丸對肝癌細(xì)胞STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，西黃丸低、中、高劑量組的p-STAT3蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。與西黃丸低劑量組比較，西黃丸高劑量組的p-STAT3蛋白表達(dá)顯著降低，見表3。3個(gè)劑量組的Western blot條帶見圖3。

表3 不同濃度的西黃丸對肝癌細(xì)胞STAT3及p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較：*P<0.05；與西黃丸低劑量組比較：#P<0.05

圖3 Western blot法檢測西黃丸對人肝癌細(xì)胞株HepG2中p-STAT3及STAT的影響

3 討論

原發(fā)性肝癌是人類常見的惡性腫瘤之一，惡性程度較高，肝臟移植和外科手術(shù)切除是目前臨床上的主要治療手段，肝癌的臨床轉(zhuǎn)移率較高，侵襲和轉(zhuǎn)移是肝癌的顯著特征，同時(shí)也是肝癌患者預(yù)后較差的重要原因之一，因此找尋出肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控和分子機(jī)制對于指導(dǎo)臨床具有積極的科學(xué)意義。西黃丸始載于《外科證治全生集》，為清代名醫(yī)王洪緒所創(chuàng)，原稱為犀黃丸，由牛黃、麝香、乳香及沒藥組成，方中牛黃性涼、味甘、苦，具有化痰利膽、清熱解毒之效；麝香性溫、性溫、味辛，具有消腫散結(jié)之效；乳香沒藥相須為用，具有消腫止痛、行氣活血之效。諸藥合用，既可消腫散堅(jiān)、活血祛瘀，又可解毒散結(jié)、益氣扶正，以達(dá)到去邪而不傷正的治療癌癥的目的?，F(xiàn)代藥理研究[7-8]表明，西黃丸對乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌細(xì)胞均有一定的抑制作用，同時(shí)還可緩解化療藥物產(chǎn)生的副作用。增殖和侵襲是肝癌細(xì)胞的基本特點(diǎn)，本研究MTT結(jié)果顯示，西黃丸對肝癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，呈時(shí)間和劑量依賴性(P<0.05)，同時(shí)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)也得出，與對照組比較，西黃丸低、中及高劑量組肝癌細(xì)胞的侵襲作用均顯著減弱，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示西黃丸可緩解肝癌細(xì)胞的異常增殖及侵襲作用。STAT3為STATs家族的重要成員之一，定位于人體第12號染色體上，是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳遞和基因表達(dá)的調(diào)控因子，其下游的靶基因主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移等。正常情況下，未活化的STAT3存在于細(xì)胞質(zhì)中，而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，由于某些細(xì)胞因子或者生長因子的失調(diào)，將會導(dǎo)致STAT3異常激活并且長時(shí)間的處于高表達(dá)狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡[9-10]?；|(zhì)金屬蛋白酶是一種鋅離子依賴性的內(nèi)肽酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞基底膜的蛋白水解酶，既往研究[11-13]顯示，MMP-2和MMP-9均是STAT3調(diào)控細(xì)胞增殖和侵襲的靶基因，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，基質(zhì)的異常降解可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的生長失去控制，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥的產(chǎn)生、重塑及浸潤轉(zhuǎn)移，故而MMP在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)即是STAT3與MMP細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜的破壞與降解[11-13]。本研究RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，西黃丸低、中、高劑量組的MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，蛋白水平上也證實(shí)，與對照組比較，西黃丸低、中、高劑量組的p-STAT3蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，提示西黃丸可通過下調(diào)p-STAT3蛋白表達(dá)來發(fā)揮抗肝癌的作用。

綜上所述，西黃丸可顯著抑制HepG2肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲作用，機(jī)制可能與抑制STAT3異常激活有關(guān)。