劉 乾, 管思彬, 韓鋒鋒, 郭雪君

(上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院, 上海 200062)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種以氣流受限為特征的常見呼吸系統(tǒng)疾病，其患病率及死亡率近年來上升迅速，到2020年，COPD將成為全球第三大致死疾病[1]。氣道重塑是COPD發(fā)生發(fā)展中氣流受限的重要病理生理學基礎，主要發(fā)生在直徑小于2 mm的小氣道，突出表現(xiàn)為氣道上皮組織的異常修復和肌成纖維細胞的募集[2,3], 促使細胞外基質沉積增加。目前臨床治療COPD的方案不能從根本上控制氣道重塑的進展，無法提高遠期生存率以及降低患者住院率和死亡率。因此, 針對COPD氣道重塑, 尤其是小氣道纖維化的發(fā)生機制及預防與治療已成為當今醫(yī)學領域研究的重點與熱點。

人參皂甙Rg1屬三萜類原人參三醇型皂甙，是人參總皂甙的主要成分。具有抗炎、抗氧化應激、提高認知能力等多種藥理效用。近年來, 多項研究[4,5]表明人參皂甙Rg1可以影響多種細胞的間質轉化過程，如腎小管上皮細胞、肝癌細胞、心肌細胞等。人參皂甙Rg1能否通過抑制上皮間充質轉化(EMT)降低肌成纖維細胞的募集與活化，進而減輕COPD小氣道纖維化、改善氣道重塑，目前尚無類似研究。為了解人參皂甙Rg1對COPD大鼠肺功能及肺上皮間充質轉化(EMT)的影響。本實驗初步探討了人參皂甙Rg1對COPD小氣道纖維化的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 制備COPD大鼠模型與分組

8周齡SPF級雄性SD大鼠, 體質量160～200 g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2012-0002]，飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院實驗動物中心[SYXK(滬)2013-0031]。動物分組: 隨機數(shù)字法將大鼠分為正常對照組(Normal)、COPD組(煙熏造模大鼠組)、COPD + 低劑量Rg1組(煙熏造模大鼠人參皂甙Rg1灌胃每日5 mg/kg，Rg1-5 mg)、COPD + 中劑量Rg1組(煙熏造模大鼠人參皂甙Rg1灌胃每日10 mg/kg, Rg1-10 mg)、COPD + 高劑量Rg1組(煙熏造模大鼠人參皂甙Rg1灌胃每日20 mg/kg， Rg1-20 mg)。每組10只大鼠。使用烤煙型大前門香煙(購自上海煙草集團公司，焦油含量為11 mg)，模型組每日上午在自制有機玻璃箱(容積為60 L，長寬高分別為50 cm，40 cm, 30 cm)內被動吸煙。除正常組外，每5只大鼠1箱, 每日每箱大鼠煙熏“大前門香煙”24支,分為上午和下午(上午和下午煙熏間隔5 h)，每次煙熏12支，每次煙熏時間維持40 min左右。每周煙熏6 d，持續(xù)煙熏12周。人參皂甙Rg1預處理COPD大鼠模型：在上午煙熏前30 min對人參皂甙Rg1低、中、高劑量組給予Rg1灌胃預處理，每周日測量體質量，根據(jù)體質量調整下周各組灌胃藥量。實驗結束后，2%戊巴比妥鈉按50 mg/kg的劑量腹腔注射處理動物。

1.2 大鼠肺功能檢測

連接肺功能儀各導聯(lián)，平衡肺功能儀。將大鼠仰臥位置于密閉體積掃描箱內，通過氣管插管連接大鼠與肺功能儀，機械通氣，以AniRes2005動物肺功能分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集和轉換，肺功能測定指標包括：肺動態(tài)順應性(dynamic compliance，Cdyn)、潮氣量(tidal volume，VT)和氣道阻力(lung resistance，RL)。

1.3 病理組織學分析

將肺組織于質量分數(shù)4%多聚甲醛內固定24 h,石蠟包埋，行HE染色，Masson染色后于光學顯微鏡下觀察。免疫組織化學法檢測大鼠肺組織E鈣黏蛋白(E-cadherin，E-cad)和α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達。

1.4 實時定量聚合酶鏈式反應(RT- PCR)

提取總RNA經逆轉錄后進行RT-PCR。循環(huán)條件如下: 預變性 95 ℃ 30 s; PCR反應, 95 ℃ 5 s, 60 ℃34 s, 進行40個循環(huán)。使用相對定量2-△△Ct的方法進行分析, 將記錄的CT值用2-△△Ct計算實驗組目的基因的表達量相對于正常對照組的變化倍數(shù),△△Ct=(CT目的基因-CT管家基因)實驗組-(CT目的基因-CT管家基因)正常對照組, 實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)以±s表示，采用Graphpad Prism 5.0 Software(San Diego，CA)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人參皂甙Rg1對大鼠肺功能的影響

與正常對照組相比, COPD組大鼠RL增加33.2%,Cdyn降低31% (P＜0.01)。中、高劑量人參皂甙Rg1干預可以減輕上述改變, RL分別增加23.4%和15.1%,Cdyn分別降低10.8%和8.1%, 與COPD組相比有顯著性差異(P＜0.01)。低劑量人參皂甙Rg1組的RL與COPD組相比無明顯差異(P＞0.05), 但Cdyn較COPD組增高(P＜0.01)。各組VT無顯著性差異(圖1)。

圖 1 各組大鼠肺功能檢測Figure 1 Pulmonary function of rats

2.2 人參皂甙Rg1對COPD大鼠肺氣腫的影響

肺組織病理切片HE染色后顯微鏡下觀察，正常對照組大鼠支氣管黏膜上皮結構完整，纖毛排列整齊，未見腺體增生，氣管壁光滑，肺血管平滑肌未見增厚，支氣管及血管周圍無炎癥細胞浸潤，肺泡間隔未見明顯斷裂與融合(圖2A)。COPD組見明顯的肺組織結構破壞，支氣管黏膜上皮脫落，纖毛明顯變短、倒伏，支氣管平滑肌增厚，支氣管周圍見大量炎癥細胞浸潤，有腺體增生，肺泡明顯擴張，部分肺泡間隔斷裂、融合，部分中小血管見血管壁增厚(圖2B)。COPD+Rg1低、中、高劑量組可見支氣管周圍炎癥細胞浸潤較COPD組有改善，肺組織結構破壞、肺泡擴張減輕，支氣管粘液分泌減少(圖2C、D、E)。

圖 2 肺組織HE染色(×100)Figure 2 HE staining of lung tissue (×100 magnificantion)

用平均肺泡數(shù)(mean alveoli number，MAN)和平均肺泡內襯間隔(mean linear intercept, MLI)評估肺氣腫程度。每張切片在光學顯微鏡下10×10倍采集4個視野，避開大血管和支氣管進行評估。結果(表1)顯示，COPD組MAN值最低，與Normal組比較有統(tǒng)計學差異; 中、高劑量Rg1處理組的MAN較CODP組顯著增高(P＜0.05)。COPD組MLI值最高， 與Normal組差異有統(tǒng)計學意義; 中、高劑量Rg1干預組的MLI較COPD組降低(P＜0.05)。

2.3 人參皂甙Rg1對COPD大鼠肺EMT的影響

與Normal組相比, COPD組E-cad表達明顯降低, 人參皂甙Rg1干預組E-cad表達較COPD組增高;COPD組α-SMA表達明顯升高，人參皂甙干預組α-SMA表達較COPD組降低。與Normal組相比，人參皂甙Rg1低、中、高劑量干預后, E-cad表達升高，而α-SMA表達明顯減低。用Image Pro Plus 6.0 軟件對免疫組織化學圖片中代表E-cad的深褐色顆粒和代表α-SMA的淡棕色顆粒進行統(tǒng)計分析，結果顯示各組間的E-cad和α-SMA表達差異有統(tǒng)計學意義(n=6,P＜0.05)。人參皂甙Rg1可以增加肺組織E-cad的表達, 減低α-SMA的表達(圖3)。

表 1 大鼠肺組織平均肺泡數(shù)(MAN)和肺泡內襯間隔(MLI)Table 1 Mean alveoli number (MAN) and mean linear intercept (MLI) of lung tissue in rats

以RT-PCR法檢測肺組織E-cad和α-SMA的mRNA表達水平, 以GAPDH為內參, 結果顯示，與Normal組相比, COPD組肺組織中E-cadmRNA的相對表達量明顯下降, 為Normal組的0.37 ± 0.11倍,α-SMAmRNA的相對表達量明顯增高，增高為3.29 ±0.57倍。COPD+Rg1中、高劑量組的E-cadmRNA 表達較COPD組升高，分別是Normal組的0.66 ± 0.06 倍和0.78 ± 0.07 倍，COPD +Rg1 低劑量組的E-cadmRNA表達與COPD組相比無顯著性差異。而COPD+Rg1低、中、高劑量組α-SMAmRNA 表達水平較COPD組降低, 分別是Normal組的2.45 ± 0.16倍、1.56 ± 0.30倍和1.31± 0.10倍(P＜0.05)(圖 4)。

圖 3 免疫組織化學檢測肺組織E-cad和α-SMA蛋白表達Figure 3 E-cad and α-SMA protein expression in lung tissue by in immunohistochemistry

圖 4 RT-PCR檢測肺組織E-cad和α-SMA的 mRNA表達Figure 4 E-cad and α-SMA mRNA expression in lung tissue by real-time PCR

3 討論

COPD是一種以氣流受限為特征的常見呼吸系統(tǒng)疾病，氣流受限持續(xù)存在并進行性發(fā)展，與氣道和肺對有害顆粒和氣體的異常炎癥反應增加有關。氣道重塑是COPD重要的病理生理基礎，慢性氣道炎癥損傷氣道上皮，異常修復與損傷反復進行，誘導EMT發(fā)生，表型改變的上皮細胞分泌大量細胞外基質，同時成纖維細胞在炎癥刺激下向肌成纖維細胞轉化，合成膠原、纖維連接蛋白等細胞外基質能力增強，最終導致小氣道纖維化、氣道狹窄、阻力增加。

人參為傳統(tǒng)中藥，人參皂甙Rg1活性高，作用廣泛，對中樞神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)均有積極作用[6-9]?，F(xiàn)有研究[10,11]已證實人參及其提取物能提高COPD患者1s用力呼氣量(FEV1)、FEV1/用力肺活量(FVC)，圣喬治呼吸問卷(SGRQ)結果提示生活質量有明顯改善。

本實驗使用煙熏法建立COPD大鼠模型[12]，通過肺組織病理和肺功能變化評估COPD造模是否成功。以灌胃法進行人參皂甙Rg1干預。肺組織病理HE染色結果提示，中、高劑量人參皂甙Rg1可以改善COPD大鼠肺組織破壞，減少MAN和MLI，減輕肺氣腫程度。肺功能檢測檢測結果顯示,COPD大鼠RL較正常對照組明顯升高, Cdyn顯著降低, 符合COPD肺功能改變, 而人參皂甙Rg1處理可以降低RL, 提高Cdyn, 改善肺功能。

EMT是極化的上皮細胞在生理和/或病理條件下經歷多種生物化學改變最終獲得間質細胞特性的過程，表現(xiàn)為上皮細胞標志物(E-cad、ZO-1)丟失，細胞緊密連接和粘附性下降或消失，細胞極性丟失，與正常上皮極性相關的細胞骨架結構也發(fā)生變化，侵襲和轉移能力增強，獲得間質標記物(α-SMA、vimentin、N-cadherin、S100A4 等), 最終演變?yōu)殚g質細胞(主要是成纖維細胞和肌成纖維細胞)。EMT是創(chuàng)傷愈合和組織修復的重要過程，但如果損傷和炎癥持續(xù)進行, 就會加重組織纖維化程度, 導致肝臟、腎臟和小腸等多種器官纖維化[13-15]。近年來多項研究[16,17]表明，多種損傷和應激可以誘導氣道EMT，促進COPD、哮喘和特發(fā)性肺纖維化等慢性氣道疾病的發(fā)生發(fā)展。

E-cad主要分布于支氣管上皮, α-SMA主要分布于氣道周圍及肺血管。免疫組織化學檢測結果提示, 人參皂甙Rg1可以降低COPD大鼠肺內α-SMA蛋白表達, 升高E-cad蛋白表達, 這與Mahmood等[18]的研究結果相仿。RT- PCR檢測E-cad和α-SMA在mRNA水平的表達, 結果也顯示人參皂甙Rg1降低肺內α-SMA, 升高E-cad的mRNA表達。本實驗顯示, COPD大鼠肺組織E-cad表達明顯降低, α-SMA表達顯著升高，提示香煙煙霧可以誘導肺內EMT的發(fā)生，而人參皂甙Rg1可以抑制上述變化。

實驗結果提示，人參皂甙Rg1可以減輕COPD大鼠肺氣腫程度，改善肺功能，減輕COPD肺EMT過程。人參皂甙Rg1抑制EMT的發(fā)生發(fā)展對有效治療COPD可能有積極意義。