袁 晨

（鄭州工業(yè)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451100）

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一種人類重要的病原菌，其屬于葡萄球菌屬，該菌是革蘭氏陽性菌的典型菌類，一旦被感染就會引起嚴(yán)重感染，該菌在自然界的中無處不在，金黃色葡萄球菌引起的感染占所有菌類感染的第二位.金黃色葡萄球菌的感染作為平常的感染性疾病主要包括一些皮膚組織類的感染、肺炎、腸炎、敗血癥等[1].金黃色葡萄球菌是目前世界衛(wèi)生組織的頭號難題.關(guān)于金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)一般有幾個特點而且呈現(xiàn)季節(jié)性的分布，一般金黃色葡萄球菌的發(fā)病周期多為春季和夏季，主要是由于這個季節(jié)的食物引起腐敗變化引起中毒，癥狀為嘔吐、發(fā)熱、腹瀉等[2].本研究通過金黃色葡萄球菌對小鼠致病性的實驗研究，探討該菌的致病機理.

1 材料和方法

1.1 主要材料

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株，南通恒生物科技發(fā)展有限公司；小鼠金黃色葡萄球菌分離株，實驗室自制；C57BL 小鼠（20±4）g（許可證 SCXK(湘)2014-0010）SPF級，長沙天勤生物科技有限公司；溶菌酶，鄭州市偉豐生物科技有限公司；瓊脂糖，上海耐今實業(yè)有限公司有限公司；膠回收試劑盒，上海康朗生物科技有限公司；高鹽甘露醇瓊脂，南京便診生物科技有限公司；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，南京凱恒生物科技有限公司.

1.2 主要儀器

DT-1102C型恒溫?fù)u床，上海篤特科學(xué)儀器有限公司；5424R型低溫高速離心機，北京伯輝生物科技有限公司；SPX-70S型生化培養(yǎng)箱，廣州市康恒儀器有限公司；微量加樣器10-1000μL，上海力辰儀器科技有限公司；E120AⅡ型電子天平，廈門群隆儀器有限公司.

2 實驗方法

將金黃色葡萄球菌菌株接種于SP平板上，在37℃在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，這階段取1ml陳舊菌液加入10ml新鮮液體肉湯培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，輕輕搖勻，收集混合好的培養(yǎng)液，采用平板表面涂布的方式計算實際被感染菌落數(shù)量.

將120只C57BL SPF級小鼠平均分成兩個小組，其中Ⅰ組小鼠正常接種金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株，Ⅱ組接種小鼠金黃色葡萄球菌分離株.兩個組內(nèi)分別平均分成6個小組，每個小組10只小鼠，每個小組小鼠進行品皮下注射接種濃度為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，并且每只 C57BL 小鼠的注射 200μL.

確定小鼠感染后，每隔3h觀察一次，整體觀察時間為14天，期間觀察小鼠的精神狀態(tài)，并且記錄小鼠的外觀變化、發(fā)病情況、死亡情況.并且計算小鼠的半數(shù)致死量.觀察時間到14天后，處死小鼠，解剖小鼠尸體觀察其內(nèi)臟變化，以甲醛溶液固定，并且做成組織切片，通過革蘭氏染色法進行鏡檢，觀察其病理組織變化.

3 結(jié)果與分析

3.1 小鼠接種金黃色葡萄球菌的發(fā)病率、死亡規(guī)律以及檢測結(jié)果

兩組C57BL小鼠在分別接種兩種金黃色葡萄球菌之后，小鼠出現(xiàn)癥狀在2天時，4天時小鼠開始出現(xiàn)死亡情況，死亡的高峰時段集中在6天時，在經(jīng)過8天之后剩余小鼠停止死亡.實驗到14天時將剩余未死亡的小鼠處死，查看其所有內(nèi)臟的變化是否有明顯病變.結(jié)果表明：Ⅰ組中接種金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株的C57BL小鼠的發(fā)病率是70%（35/50）死亡率為54%（27/50）；Ⅱ組接種小鼠金黃色葡萄球菌分離株C57BL小鼠的發(fā)病率是90%（45/50）死亡率為 74%（37/50）.采取 SP 培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)特異性的PCR擴增結(jié)果與上述兩組實驗的結(jié)果是相似的，所以上述兩種方法均可以檢測出金黃色葡萄球菌實驗菌.

3.2 小鼠接種金黃色葡萄球菌的臨診狀態(tài)

C57BL小鼠在接種金黃色葡萄球菌2天時，通過觀察兩組小鼠的狀態(tài)表明大部分的小鼠精神狀態(tài)較差，活動較少，飲食飲水較少，背毛聳立，肛門周圍的污穢物較多并且黏性較大.隨著時間的加長在第5、6天時，小鼠的病情逐漸加重，小鼠面部逐漸發(fā)青并且持續(xù)加深，小鼠腹部皮下接種的位置呈現(xiàn)青紫色.8天之后小鼠的狀況極度衰弱，頭部和面部呈現(xiàn)水腫狀態(tài)，小鼠腹部皮下接種的位置出現(xiàn)病變伴隨著化膿情況.最終所有小鼠聚集在一起保持靜止?fàn)顟B(tài)，其中一些病癥較為嚴(yán)重的小鼠出現(xiàn)死亡，對照組小鼠正常生活，飲食飲水正常，未出現(xiàn)任何癥狀.

3.3 小鼠接種金黃色葡萄球菌肉眼病變狀態(tài)

C57BL小鼠在接種金黃色葡萄球菌之后，隨著時間的延長，小鼠的各個組織出現(xiàn)大面積病變，其中包括脾臟水腫、肺部淤血、肝臟表面可以發(fā)現(xiàn)小膿包并且腫大；小鼠胸腺發(fā)生大面積淤血；腎臟出現(xiàn)顏色逐漸變淺水腫；小鼠胃部出現(xiàn)潰瘍，水腫.對照組小鼠未出現(xiàn)任何癥狀，肉眼病變.

3.4 小鼠接種金黃色葡萄球菌病理組織狀態(tài)

C57BL小鼠在接種金黃色葡萄球菌之后，通過14天的實驗將所有未死亡的小鼠處死之后，解剖小鼠查看其各個組織的病理變化.小鼠肝臟出現(xiàn)大面積淤血，而且萎縮的嚴(yán)重；小鼠肺臟出現(xiàn)大面積淤血還伴隨著水腫；小鼠脾臟出現(xiàn)壞死情況，脾臟內(nèi)部平滑肌變性；小鼠腎臟出現(xiàn)大面積水腫，腎臟血管擴張，壞死.

3.5 小鼠接種金黃色葡萄球菌LD50的檢測結(jié)果

通過將兩組C57BL小鼠分別接種金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株與小鼠金黃色葡萄球菌分離株之后，通過采用Karber法來計算LD50數(shù)值，我們可以按照公式Log LD50=L+d（S-0.5），其中L表示的是金黃色葡萄球菌最低濃度稀釋的對數(shù)，公式中的d表示的是各個組間的距離，公式中的s表示小鼠接種金黃色葡萄球菌之后發(fā)生死亡率的比值的和.其中接種金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株的C57BL小鼠的LD50的數(shù)值為4.21，接種小鼠金黃色葡萄球菌分離株的C57BL小鼠的LD50的數(shù)值為5.12.

表1 小鼠接種金黃色葡萄球菌LD50的檢測結(jié)果

4 結(jié)論

通過以上結(jié)果表明，兩組C57BL小鼠分別皮下腹部接種金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株以及小鼠金黃色葡萄球菌分離株之后，兩個菌種均可以導(dǎo)致C57BL小鼠死亡，但是兩者的致死小鼠的周期不盡相同，首先小鼠分別皮下腹部接種金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株的死亡周期為6天，而小鼠分別皮下腹部接種小鼠金黃色葡萄球菌分離株的死亡周期為4天，表明黃色葡萄球菌分離株的毒性比金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株要強.

從以上結(jié)果得出，C57BL小鼠對金黃色葡萄球菌的比較敏感，這給臨床制備該類疫苗提供了很好的動物模型，這對后期人工接種該類疫苗之后出現(xiàn)的反應(yīng)癥狀提供了寶貴的經(jīng)驗和理論依據(jù).