趙志靖, 第五飛虎, 鄧毅恒, 楊利孫

(長安醫(yī)院神經(jīng)外科, 西安710016)

腦出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是嚴(yán)重威脅人類健康與生活質(zhì)量的高致死率和高致病率的臨床常見病[1]。ICH后血腫形成過程中會釋放大量血清，血清中含有大量生長因子、炎癥因子等可能會與ICH后周圍組織水腫有關(guān)[1]。水通道蛋白(AQPs)家族是一組構(gòu)成水通道與水通透有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 腦組織中AQPs主要為AQP-4, AQP-4在腦內(nèi)主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦表面的軟腦膜、腦室系統(tǒng)的室管膜等, 在維持大腦水平衡發(fā)揮重要作用[2]。本實驗旨在探討大鼠腦實質(zhì)注射血清所致病理改變以及血清對AQP-4的影響, 以期進(jìn)一步解釋腦出血后繼發(fā)性腦水腫的病理生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

成年雄性清潔級SD大鼠60只，體質(zhì)量(250±30) g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心[SCXK(軍)2012-0007]。大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞株(R1800)購自上海中喬新舟生物科技有限公司。兔抗大鼠AQP-4抗體購自美國Abcam公司，山羊抗兔二抗、胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、丙酮酸鹽溶液均購自美國Thermo Fisher公司?？俁NA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司。腐胺、亞硒酸鹽、多聚賴氨酸均購自美國Sigma公司。

1.2 動物分組與動物模型的建立[3]

60只大鼠隨機(jī)分成實驗組與對照組，每組各30只。造模前一周進(jìn)行平衡木訓(xùn)練。實驗組處理方法:使用異氟烷氣體麻醉大鼠，固定于立體定位儀，暴露實驗鼠前囟，在前囟右側(cè)旁開3 mm處鉆開顱骨，微量注射器注射20 μL常溫10%FBS，深度為5 mm, 注射速度為1 μL/min。注射后停留10 min退針。對照組處理方法: 僅微量注射器注射20 μL生理鹽水，其余處理同實驗組。兩組均在術(shù)后48 h進(jìn)行行為學(xué)評分，評分后處死大鼠取材，兩組各隨機(jī)選取20只大鼠腦實質(zhì)組織提取總蛋白或總RNA后置于-70 ℃冰箱保存，其余均用于腦含水量測定。

1.3 行為學(xué)觀察

參考文獻(xiàn)所述方法[4]，利用平衡木評分法對術(shù)后48 h兩組大鼠進(jìn)行評估，觀察其行為學(xué)變化。讓大鼠通過升高的平衡木，進(jìn)入較暗的飼養(yǎng)箱。評分標(biāo)準(zhǔn)如下: 0分，能跳上平衡木，在上面行走不會跌倒; 1分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒機(jī)會少于50%; 2分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒機(jī)會大于或等于50%; 3分，在健側(cè)后肢的幫助下能跳上平衡木，但受累癱瘓側(cè)后肢不能幫助向前移動; 4分，在平衡木上不能行走，但可以坐在上面; 5分，將大鼠放在平衡木上會掉下來。3次測試結(jié)果的平均分作為最后成績。

1.4 腦實質(zhì)含水量測定

采用干濕質(zhì)量法對大鼠腦實質(zhì)含水量進(jìn)行測定，術(shù)后48 h處死大鼠取腦組織，將腦組織稱濕重后立即放入恒溫電烤箱內(nèi)8 h, 設(shè)置溫度為120 ℃，稱取干質(zhì)量。腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

1.5 腦實質(zhì)組織學(xué)觀察

制備常規(guī)標(biāo)本，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察; 制備電子顯微鏡標(biāo)本，經(jīng)半薄切片定位制成超薄切片，在透射電子顯微鏡下觀察。

1.6 細(xì)胞無血清培養(yǎng)及實驗分組

大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞株用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)液)置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)90%細(xì)胞貼壁時，用胰酶消化傳代。實驗前24 h，調(diào)整細(xì)胞濃度，按照1.5×105/cm2接種到已經(jīng)包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)板上，15 min后將上清去掉，添加新鮮無血清培養(yǎng)基或者血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基(SFM)配方參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行配置。按照SFM和有血清培養(yǎng)基[無血清培養(yǎng)基加入10%FBS(SFM+10%FBS)]，隨機(jī)分為SFM組與SFM+10%FBS組，細(xì)胞分別在SFM和SFM+10%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，提取總蛋白或總RNA后置于-70 ℃冰箱保存。

1.7 蛋白免疫印跡

從組織或細(xì)胞提取的蛋白用100 g/L SDS-PAGE電泳分離, 轉(zhuǎn)膜、室溫封閉后, 分別加兔抗AQP-4(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入羊抗兔二抗(1∶2 500)孵育2 h，洗膜后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色、顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析，并以β-actin為內(nèi)參。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄PCR

用組織或細(xì)胞提取的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA，以該cDNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測AQP-4的轉(zhuǎn)錄水平，并以β-actin為內(nèi)參。引物由空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院肝膽外科實驗室設(shè)計，AQP-4引物上游序列: 5'-TTGGACCATCATAGGCGC-3', 下游序列: 5'-GCATGTGATCGACATTGACC-3', 擴(kuò)增片段長214 bp; β-actin引物上游序列: 5'-ACTCCAACACCCCAGCCATG-3', 下游序列:5'-CTGATCCACATCTGCTGGAAGGTGG-3'，擴(kuò)增片段長698 bp, 相關(guān)引物均由上海生工公司合成。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，每組實驗均重復(fù)3次, 計量資料用x-±s表示, 兩組資料之間比較采用t檢驗，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠生存率、行為學(xué)評分及腦實質(zhì)含水量的差異

實驗組大鼠死亡6只, 生存率為80.00%, 對照組大鼠死亡1只, 生存率為96.67%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。平衡木行為學(xué)評分, 實驗組和對照組分別為(4.50± 0.35)分和(2.73± 0.37)分(P＜0.05)。大鼠注射部位腦組織含水量，實驗組和對照組分別為80.12%±0.51%和77.22%±0.35%(P＜0.05); 實驗組和對照組大鼠注射部位對側(cè)腦組織含水量分別為76.10%±0.03%和76.45%±0.04%(P＞0.05)。

2.2 兩組大鼠腦組織超微結(jié)構(gòu)的差異

兩組大鼠腦組織經(jīng)常規(guī)HE染色, 光學(xué)顯微鏡下對照組大鼠注射部位周圍組織大致正常, 未見明顯異常(圖1A1), 實驗組大鼠注射部位周圍組織呈輕度到中度水腫(圖1B1)。透射電子顯微鏡觀察顯示, 相對于對照組(圖1A2), 可見星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體容積增大,細(xì)胞質(zhì)疏松, 細(xì)胞器減少, 細(xì)胞核增大, 甚至部分細(xì)胞核核體脹破, 少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為氣球樣變(圖1B2)。

圖 1 兩組大鼠腦組織HE染色(×100)和超微結(jié)構(gòu)的差異(×10 000)

圖 2 兩組大鼠腦實質(zhì)AQP-4蛋白及mRNA表達(dá)的差異

2.3 兩組大鼠腦實質(zhì)AQP-4表達(dá)的差異

實驗組大鼠注射部位腦組織AQP-4蛋白及mRNA表達(dá)量顯著低于對照組，同樣顯著低于對側(cè)腦組織(P＜0.01); 實驗組注射部位對側(cè)腦組織AQP-4蛋白及mRNA表達(dá)量與對照組未見明顯差異(P＞0.05)(圖 2)。

2.4 血清對星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)AQP-4的影響

相對于SFM組, SFM+10%FBS組表達(dá)AQP-4蛋白及mRNA均明顯下降(P＜0.05)(圖3), 顯示血清可直接從轉(zhuǎn)錄水平抑制大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4的表達(dá)。

3 討論

圖 3 血清抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4蛋白及mRNA的表達(dá)

ICH后首先由于血腦屏障破壞導(dǎo)致血管源性腦水腫, 然后繼發(fā)性的細(xì)胞毒性腦水腫進(jìn)一步加重病灶周邊腦實質(zhì)細(xì)胞損傷, 導(dǎo)致嚴(yán)重的腦水腫發(fā)生[6-7]。ICH后病灶周圍組織水腫的發(fā)生可能與病灶炎癥因子釋放、激活相應(yīng)的信號通道密切相關(guān)，然而，血腦屏障破壞后，血管外的血清是否直接導(dǎo)致病灶周邊腦實質(zhì)細(xì)胞的水腫，目前并不清楚。本研究利用大鼠腦實質(zhì)注射模型證實血清可導(dǎo)致注射部位側(cè)含水量明顯增加; 組織經(jīng)光學(xué)顯微鏡與透射電子顯微鏡觀察均見組織與細(xì)胞水腫; 實驗組大鼠48 h生存率下降、大鼠肢體活動、平衡力明顯下降，顯示血清可直接導(dǎo)致腦實質(zhì)水腫的發(fā)生。該大鼠腦實質(zhì)注射血清模型，模擬ICH后滲出的血清對腦組織的病理過程，結(jié)果顯示ICH后血清滲出刺激，是ICH后病灶周圍細(xì)胞水腫的重要機(jī)制，該機(jī)制是否能進(jìn)一步解釋長期服用阿司匹林引起的ICH患者預(yù)后相對較差的情況，尚需要進(jìn)一步深入研究。

研究表明, ICH后星形膠質(zhì)細(xì)胞可出現(xiàn)形態(tài)學(xué)、遷移能力上的改變, 表現(xiàn)為細(xì)胞核增大、胞體肥大、氣球樣變等水腫病理損傷改變[8-10]。在研究如何純化與培養(yǎng)嚙齒類動物星形膠質(zhì)細(xì)胞實驗中，同樣顯示血清所導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞相同的形態(tài)學(xué)改變[11]。在本研究中同樣觀察到，培養(yǎng)基中加入10%FBS后，在倒差顯微鏡下觀察大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，可見細(xì)胞胞體容積增大，細(xì)胞質(zhì)疏松，細(xì)胞核增大，甚至部分細(xì)胞核核體脹破，少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為氣球樣變，結(jié)合動物實驗結(jié)果顯示，血清可直接導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞毒性水腫。

AQPS主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)水，腦組織中AQPS主要為AQP-4，AQP-4在腦內(nèi)主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞、腦表面的軟腦膜、腦室系統(tǒng)的室管膜等, 是星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦脊液以及血管之間的水調(diào)節(jié)和運(yùn)輸?shù)闹匾ǖ赖鞍? 參與腦脊液重吸收、腦細(xì)胞滲透壓等調(diào)節(jié), 在維持大腦水平衡發(fā)揮重要作用[11-14]。越來越多的研究表明[15-18]，AQP-4在血管源性腦水腫形成中起重要的作用，AQP-4基因敲除后，可誘發(fā)實驗動物發(fā)生血管源性腦水腫。本研究顯示血清可導(dǎo)致注射部位側(cè)腦實質(zhì)腦水腫的發(fā)生，同時腦實質(zhì)AQP-4蛋白及mRNA表達(dá)均明顯下降，提示AQP-4可能是血清引起到腦組織水腫的重要分子機(jī)制。進(jìn)一步實驗表明，在培養(yǎng)基中添加10%FBS可引起大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4蛋白及mRNA表達(dá)的下降，同時引起細(xì)胞胞體容積增大，細(xì)胞質(zhì)疏松, 細(xì)胞核增大，甚至部分細(xì)胞核核體脹破，少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為氣球樣變，顯示AQP-4表達(dá)下降，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)腦組織內(nèi)滲透壓、水平衡的能力下降，無法將腦實質(zhì)內(nèi)多余水分排出, 從而導(dǎo)致腦水腫發(fā)生。盡管本實驗在體內(nèi)與體外均證實血清直接刺激腦水腫與細(xì)胞水腫的發(fā)生，然而血清中成分復(fù)雜，含有大量生長因子、活化因子，具體哪一種成分是導(dǎo)致腦實質(zhì)及星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)AQP-4下降尚需要進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，本研究利用大鼠腦實質(zhì)注射血清模型，模擬ICH后血清對周圍腦組織的影響，結(jié)果證實血清可直接導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生，同時伴隨AQP-4表達(dá)下降。進(jìn)一步的體外實驗證實，血清同樣可導(dǎo)致大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的發(fā)生，同時伴隨AQP-4蛋白及mRNA表達(dá)下降，體外與體內(nèi)實驗共同表明，血清導(dǎo)致腦組織、尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP-4表達(dá)下降可能是ICH后繼發(fā)性腦水腫的重要分子機(jī)制，為未來治療ICH后腦水腫治療提供新的治療靶點(diǎn)。