邢 瀟 宋如昕 王 蘭 牛翠娟 張左兵

(1. 山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 太原 030006; 2. 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100875)

中華鱉(Pelodiscus sinensis)屬于脊索動物門、脊索動物亞門、爬行綱、無孔亞綱、龜鱉目、曲頸龜亞目、鱉科。中華鱉是一種外溫動物, 水陸兩棲, 在我國廣泛分布(除青海、西藏、新疆地區(qū)), 其中以長江流域和華南地區(qū)較為多見, 國外主要分布于朝鮮、日本和越南等地[1]。由于中華鱉具有極高的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟(jì)價值和科研價值[2], 其養(yǎng)殖逐步形成了適度規(guī)?；牡胤絻?yōu)勢特色產(chǎn)業(yè), 但隨著該產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展, 疾病已成為制約其健康可持續(xù)發(fā)展的重要因素。

在中華鱉大規(guī)模分布的區(qū)域, 經(jīng)常會出現(xiàn)氣溫驟然變化的情況, 且多發(fā)生于5月和10月。這種氣溫驟然變冷會造成養(yǎng)殖中華鱉出現(xiàn)“感冒”癥狀, 并呈暴發(fā)性死亡, 給中華鱉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來重大損失。但目前尚不清楚, 病原是如何造成這種死亡的。腸道是機(jī)體長期與外界直接接觸的器官, 在正常的生理情況下腸道黏膜的多種屏障可以有效阻止腸腔內(nèi)的病原體侵入機(jī)體, 但在應(yīng)激狀態(tài)下, 腸黏膜通透性增加, 腸腔內(nèi)的病原體透過腸黏膜侵入機(jī)體,誘發(fā)炎癥反應(yīng)[3—5]。因此, 中華鱉腸道可能是病原入侵的潛在門戶。腸道黏膜屏障主要是由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫和生物屏障構(gòu)成。其中機(jī)械屏障屬于機(jī)體第一道防線。該防線由腸黏膜表面的黏液層、黏膜上皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成,能有效阻止細(xì)菌透過黏膜進(jìn)入組織[6—8]。因此, 維持正常的腸道黏膜機(jī)械屏障的功能對保證動物腸道生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要意義。

監(jiān)測腸道黏膜機(jī)械屏障功能是判斷腸道黏膜屏障完整性的的重要依據(jù)之一, 但目前很難直接觀察腸道黏膜機(jī)械屏障的功能, 多通過間接的方法進(jìn)行檢測。臨床上常用以下幾種方法進(jìn)行檢測: 腸黏膜通透性測定、血漿內(nèi)毒素檢測、腸黏膜pH測定及二胺氧化酶測定。二胺氧化酶(Diamine oxidase,DAO)是主要存在于小腸的黏膜或纖毛上皮細(xì)胞中催化二胺的細(xì)胞內(nèi)酶, 小腸黏膜屏障功能衰竭時或腸黏膜細(xì)胞壞死時血清DAO活性升高[9,10]。因此,血液中的DAO活性能夠很好的反映腸道損傷狀態(tài)。

DAO活性和腸道黏膜組織結(jié)構(gòu)是反應(yīng)腸道黏膜機(jī)械屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性的重要指標(biāo)。應(yīng)激反應(yīng)會造成大鼠腸道黏膜受損, 光鏡觀察發(fā)現(xiàn)應(yīng)激會造成大鼠腸黏膜絨毛腫脹變短, 頂端脫落并伴有炎性滲出物, 電鏡觀察亦可見絨毛倒伏、脫落,形態(tài)結(jié)構(gòu)不清等類似現(xiàn)象, 呈現(xiàn)時間依賴性[11]。并伴隨著血清二胺氧化酶DAO濃度的顯著升高。

鑒于此, 本文以中華鱉幼鱉為動物模型, 系統(tǒng)的探討冷脅迫對DAO活性、腸道黏膜組織形態(tài)的影響, 初步探討了急性冷脅迫對腸道黏膜組織學(xué)特征的影響, 旨在為經(jīng)常遭受急性冷脅迫的中華鱉正常生理機(jī)能維持提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與馴養(yǎng)

健康中華鱉幼鱉購自河北省玉田縣中華鱉良種場。急性冷脅迫實(shí)驗(yàn)先后進(jìn)行了2次, 其中第一次急性冷脅迫實(shí)驗(yàn)用32只, 體重(116.5±25.30) g; 急性冷脅迫及復(fù)溫實(shí)驗(yàn)用45只, 體重(128.4±15.72) g。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)2周, 養(yǎng)殖期間每日投喂商品化飼料并換水, 水溫維持在(25±1)℃。降溫前12h, 對照組和實(shí)驗(yàn)組動物均開始禁食, 直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

動物分組和組織標(biāo)本取材實(shí)驗(yàn)分為兩部分。第一部分為第一次急性冷脅迫實(shí)驗(yàn): 馴化后的中華鱉隨機(jī)分為4組, 每組8只。分別在冷脅迫開始后的0、6h、24h和48h取血, 其中0組為對照組。

第二部分為急性冷脅迫及復(fù)溫實(shí)驗(yàn): 馴化后的中華鱉隨機(jī)分成5組, 每組9只。其中冷脅迫前25℃對照組為C0組, 冷脅迫3d 25℃對照組為C3d組, 冷脅迫3d 15℃組為T3d組, 冷脅迫11d 25℃對照組為C11d組, 15℃冷脅迫8d后迅速升溫至25℃并維持3d為T8d+3d組, 其中溫度維持在25℃的組別為對照組。在斷頭法處死中華鱉后, 取血。迅速開腹, 于回腸后端和大腸處取0.5 cm腸段置于4%中性多聚甲醛中固定, 以備PAS染色觀察病理變化。

在實(shí)驗(yàn)過程中, 使用冷水機(jī)將水溫從25℃迅速降至15℃, 各組中華鱉于各相應(yīng)時間點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)本取材。

血清DAO活性檢測用斷頭法取血2 mL,37℃放置1h后, 4℃過夜, 3000 r/min于4℃離心10min, 取上層血清置于-80℃冰箱保存待測。用活性比色法測定DAO (南京建成生物工程研究所)的活性。

腸黏膜的病理學(xué)觀察組織標(biāo)本取材經(jīng)4%多聚甲醛固定, 常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋,制成3 μm厚切片。將切片依次浸入二甲苯10min,二甲苯10min, 無水乙醇, 95%乙醇, 75%乙醇, 蒸餾水各5min, 0.5%高碘酸10min, 流水沖洗2min,Schiff氏液避光染色40min, 流水沖洗5min, 蘇木精染色3min, 流水沖洗5min, 1%鹽酸酒精分色1s, 酒精脫水, 二甲苯透明, 中性樹膠封片, 光鏡觀察。圖像分析采用ImageJ2x專業(yè)圖像分析軟件(Broken Symmetry Software公司)。每個腸管取5張切片, 每張切片選取5個最長腸絨毛的長度、最深隱窩深度和最厚黏膜厚度以及單位面積內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行測量。

統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示, 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件, 多組間樣本比較采用單因素方差分析, 兩組間樣本比較采用最小顯著差異t檢驗(yàn)(LSD-t), 對各組均數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清DAO活性

第一次急性冷脅迫對中華鱉血清DAO活性的影響由圖 1可知, 中華鱉血清DAO活性隨急性冷脅迫時間的增加而呈現(xiàn)降低趨勢。急性冷脅迫48h組的血清DAO活性顯著低于對照組(P=0.0289),急性冷脅迫6h組的血清DAO活性顯著高于急性冷脅迫48h組(P=0.0315), 急性冷脅迫24h組的血清DAO活性極顯著高于急性冷脅迫48h組(P=0.0081)。

急性冷脅迫及復(fù)溫對中華鱉血清DAO的影響

急性冷脅迫3d組T3d的血清DAO活性顯著低于其他各組(圖 2)。急性冷脅迫前對照組C0的DAO活性顯著高于冷脅迫3d組T3d(P=0.049), 急性冷脅迫3d對照組C3d的DAO活性極顯著高于急性冷脅迫3d組T3d(P=0.0044), 急性冷脅迫11d對照組C11d和冷脅迫8d后迅速升溫至25℃并維持3d組T8d+3d的DAO活性均顯著高于冷脅迫3d組T3d(P=0.0381)。

2.2 腸道黏膜病理學(xué)觀察

腸道黏膜上皮的形態(tài)學(xué)變化光鏡下觀察發(fā)現(xiàn), 急性冷脅迫后各組中華鱉的腸黏膜結(jié)構(gòu)完整,層次分明, 腸黏膜上皮細(xì)胞的輪廓清晰, 染色鮮明,排列規(guī)則, 杯狀細(xì)胞清晰(圖 3、圖 4)。腸黏膜表面的紋狀緣結(jié)構(gòu)整齊均勻。固有層結(jié)構(gòu)清晰, 上皮細(xì)胞呈正常生長更新狀態(tài)。急性冷脅迫后, 中華鱉回腸后段和大腸的黏膜形態(tài)并未發(fā)生明顯變化。

圖 1 第一次急性冷脅迫后中華鱉血清DAO活性Fig. 1 The DAO activity of Chinese soft-shelled turtle during the first acute cold stress experiment

圖 2 急性冷脅迫及復(fù)溫實(shí)驗(yàn)中各組中華鱉血清DAO活性Fig. 2 The DAO activity of Chinese soft-shelled turtle in acute cold stress and rewarming experiments

回腸后段和大腸杯狀細(xì)胞數(shù)目變化通過ImageJ2x軟件計算單位面積/像素內(nèi)杯狀細(xì)胞的數(shù)目可得表 1和圖 5 , 可知: 在急性冷脅迫后, 各組中華鱉回腸后段杯狀細(xì)胞數(shù)與對照組相比沒有顯著變化(P=0.098), 急性冷脅迫3d組杯狀細(xì)胞數(shù)目顯著低于急性冷脅迫3d對照組大腸的杯狀細(xì)胞數(shù)目(P＜0.001)。

中華鱉回腸后段絨毛長度、腸壁厚度/大腸腸壁厚度變化急性冷脅迫對中華鱉回腸后段絨毛長度、黏膜厚度和大腸黏膜厚度的影響見表 2和圖 6—8。由圖 4可知, 大腸由于沒有腸絨毛, 因此不對其絨毛長度進(jìn)行統(tǒng)計。由表 2 和圖 6可知, 急性冷脅迫3d組的回腸后段絨毛長度要低于急性冷脅迫3d對照組, 但總體來說沒有顯著影響(P=0.077)。由圖 7可知: 中華鱉回腸后段急性冷脅迫3d組黏膜厚度顯著低于急性冷脅迫3d對照組(P=0.0015), 中華鱉回腸后段急性冷脅迫8d后迅速升溫至25℃并維持3d組黏膜厚度顯著高于急性冷脅迫11d對照組(P=0.009); 急性冷脅迫對中華鱉大腸黏膜厚度沒有顯著影響(P=0.3626)。由圖 8可知: 急性冷脅迫對中華鱉回腸后段絨毛長度和隱窩深度的比值沒有顯著影響(P=0.079)。

3 討論

3.1 急性冷脅迫引起的腸道黏膜屏障組織化學(xué)損傷

研究表明: 脅迫可引起腸黏膜屏障通透性升高, 導(dǎo)致胃腸功能紊亂和病變。DAO可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的離子平衡、影響傳導(dǎo)通路、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù),對腸黏膜具有保護(hù)作用[12]。DAO最初在小腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn), 主要分布在小腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞中, 占95%, 少量分布在胎盤和腎臟, 其他組織和細(xì)胞中含量較少[13]。正常機(jī)體血清DAO活性很低, 當(dāng)腸黏膜損受傷時, 導(dǎo)致血清DAO活性增高[14]。DAO酶活的變化是研究創(chuàng)傷后腸屏障功能損傷的理想指標(biāo), 尤其是血清中DAO酶活變化[15],因此血清DAO活性是反映腸黏膜損受的理想指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示: 無論是在第一次急性冷脅迫實(shí)驗(yàn), 還是急性冷脅迫及復(fù)溫實(shí)驗(yàn)中, 急性冷脅迫均會使中華鱉血清DAO活性顯著低于各對照組, 且隨著溫度的恢復(fù), 血清DAO的活性也顯著升高, 這與黎友軍等[16]的研究結(jié)果相反。在本研究中, DAO活性的降低會隨溫度的升高而恢復(fù)。由于DAO主要分布在小腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞中, 這提示我們急性冷脅迫未造成小腸黏膜屏障功能破壞。另一個可能原因是, 低溫造成DAO在小腸合成減少, 在小腸屏障功能沒有受到破壞的情況下, 進(jìn)入血清DAO減少。

圖 3 急性冷脅迫對中華鱉回腸后段黏膜上皮組織形態(tài)影響的顯微照片(PAS染色×400)Fig. 3 Micrograph of acute cold stress on the mucosal epithelial tissue morphology of the posterior ileum of Chinese soft-shelled turtle (PAS staining×400)

F. 冷脅迫前對照組; G. 冷脅迫3d對照組; H. 冷脅迫3d組; I. 冷脅迫11d對照組; J. 冷脅迫8d后迅速升溫至25℃并維持3d組; 箭頭所指為杯狀細(xì)胞F. control group before cold stress; G. control group at day 3 after acute cold stress; H. cold stress group at day 3 day; I. control group at day 11 after acute cold stress; J. cold stress group at day 8 and maintained at 25℃ for 3 days. The arrows refer to goblet cells

表 1 急性冷脅迫對中華鱉回腸后段/大腸杯狀細(xì)胞數(shù)的影響Tab. 1 Effects of acute cold stress on the number of goblet cells in the posterior segment of ileum/the large intestine in Pelodiscus sinensis

圖 5 急性冷脅迫及復(fù)溫實(shí)驗(yàn)中回腸后段/大腸杯狀細(xì)胞數(shù)目變化Fig. 5 The number of goblet cells in the posterior segment of ileum/the large intestine in acute cold stress and rewarming experiments

腸道黏膜上皮杯狀細(xì)胞分泌的黏液在黏膜表面形成疏水的黏液凝膠層, 主要成分是黏液糖蛋白,它覆蓋腸上皮表面, 可阻抑消化道中的消化酶和有害物質(zhì)對上皮細(xì)胞的損害[17]。有研究表明: 應(yīng)激會使豬黏液IgA蛋白的表達(dá)發(fā)生紊亂[18]。黏液層的不斷更新和維持對于機(jī)體腸道屏障十分重要, 黏液層的維持主要由部分腸杯狀細(xì)胞中的單個細(xì)胞定期進(jìn)行基礎(chǔ)分泌完成[19]。因此, 腸道上皮中的杯狀細(xì)胞的數(shù)目在一定程度上可以間接反映黏液層的狀況, 對于判斷機(jī)體腸道黏膜屏障的完整性具有重要意義。在本實(shí)驗(yàn)中: 在急性冷脅迫后, 中華鱉各組回腸后段杯狀細(xì)胞數(shù)目沒有顯著變化, 急性冷脅迫3d組杯狀細(xì)胞數(shù)目顯著低于急性冷脅迫3d對照組大腸的杯狀細(xì)胞數(shù)目, 提示急性冷脅迫可能會使中華鱉大腸黏液層穩(wěn)定性發(fā)生改變, 從而破壞大腸黏膜機(jī)械屏障。

表 2 急性冷脅迫及復(fù)溫對中華鱉回腸后段絨毛長度、腸壁厚度、大腸腸壁厚度及絨毛長度隱窩深度的影響Tab. 2 Effects of acute cold stress and rewarming on villus length, intestinal wall thickness in the posterior segment of ileum, intestinal wall thickness in the large intestine and the villi length/crypt depth of Chinese soft-shelled turtle

圖 6 急性冷脅迫及復(fù)溫實(shí)驗(yàn)中回腸后段腸絨毛高度變化Fig. 6 Intestinal villus height in the posterior segment of ileum during acute cold stress and rewarming experiments

圖 7 急性冷脅迫及復(fù)溫實(shí)驗(yàn)中回腸后段/大腸黏膜厚度變化Fig. 7 Changes of colorectal mucosa in the posterior segment of ileum/large intestine during acute cold stress and rewarming experiment

3.2 急性冷脅迫引起的腸道黏膜組織形態(tài)損傷

圖 8 急性冷脅迫及復(fù)溫實(shí)驗(yàn)中回腸后段絨毛長度/隱窩深度(V/C)變化Fig. 8 Ratios of villus length/crypt depth (V/C) in posterior segment of ileum during acute cold stress and rewarming experiment

有研究表明脅迫會引起腸道黏膜上皮結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。如虹鱒(Oncorhynchus mykiss)在急性脅迫后, 腸道緊密連接減少, 腸道上皮通透性增加[20]; 山齒鶉(Colinus virginianus)在冷脅迫后, 觀察到腸道上皮發(fā)生損傷[21]。脅迫引起的糖皮質(zhì)素釋放因子、P物質(zhì)等神經(jīng)肽能夠造成小鼠腸道黏膜通透性增加, 會使增加病原菌入侵的機(jī)會[22,23]。張雯等[24]通過光鏡對雛雞(Gallus gallus)腸黏膜進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察, 發(fā)現(xiàn)急性、慢性冷應(yīng)激均對腸黏膜的形態(tài)有顯著的影響。他發(fā)現(xiàn)在冷脅迫后, 觀察雛雞空腸HE切片可見與對照組相比應(yīng)激組絨毛高度明顯降低, 出現(xiàn)絨毛斷裂、稀疏, 腸黏膜充血、出血、白細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 通過光鏡對腸黏膜進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察, 發(fā)現(xiàn)急性冷脅迫對中華鱉腸黏膜組織形態(tài)并無顯著影響。觀察回腸后段和大腸PAS染色切片可見, 回腸后段腸絨毛排列整齊,并未出現(xiàn)斷裂和缺失等現(xiàn)象, 大腸腸黏膜結(jié)構(gòu)完整。絨毛長度和隱窩深度反映了小腸的功能狀態(tài),比值下降, 表示黏膜受損, 消化吸收功能降低, 常伴有腹瀉的發(fā)生, 動物生長發(fā)育受阻; 比值上升, 則黏膜改善, 消化吸收功能增強(qiáng), 腹瀉率降低, 生長發(fā)育加快, 應(yīng)激反應(yīng)會使絨毛長度和隱窩深度比值降低[25]。在本實(shí)驗(yàn)中冷脅迫3d后, 絨毛長度/隱窩深度的比值低于常溫對照組, 但沒有顯著性變化。中華鱉回腸后段急性冷脅迫3d組黏膜厚度顯著低于急性冷脅迫3d對照組, 中華鱉回腸后段急性冷脅迫8d后迅速升溫至25℃并維持3d組黏膜厚度顯著高于急性冷脅迫11d對照組, 提示冷脅迫可能會使中華鱉回腸后段黏膜受損, 而隨著溫度的恢復(fù)這種損傷也會恢復(fù)。

綜上所述, 急性冷脅迫會改變中華鱉腸道黏膜機(jī)械屏障的結(jié)構(gòu), 但在不同的腸段, 這種改變是不同的, 急性冷脅迫會使大腸杯狀細(xì)胞數(shù)目降低, 降低大腸的腸道黏膜機(jī)械屏障功能。急性冷脅迫使回腸后段黏膜厚度降低, 使其通透性降低或通透性不受影響, 反應(yīng)在血漿(清)DAO活性降低。這提示,中華鱉腸道在相同的急性冷脅迫下, 不同段對急性冷脅迫具有各自特殊的應(yīng)對方式。與此同時, 我們也認(rèn)識到單從組織化學(xué)和形態(tài)學(xué)上, 不能全面的分析急性冷脅迫對中華鱉腸道黏膜機(jī)械屏障的影響,我們下一步還需要從分子和蛋白的角度進(jìn)行研究。