李寶山 孫永智 王世信 黃炳山 王際英

(山東省海洋資源與環(huán)境研究院, 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 煙臺(tái) 264006)

光照是水生動(dòng)物生長(zhǎng)過程中重要的生態(tài)因子,直接或間接影響其生長(zhǎng)、攝食、存活及繁殖內(nèi)分泌, 并通過影響“下丘腦-垂體-性腺”軸(HPGaxis),影響血液中激素含量[1]。光照對(duì)水生動(dòng)物生理的影響主要分為2種: 光照強(qiáng)度和光照周期。研究表明:光照強(qiáng)度對(duì)烏鱧(Channa Argus)[2]、褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)[3]等生長(zhǎng)、繁殖均有顯著影響; 光照周期影響了虹鱒(Oncorhynchus mykiss)幼魚免疫系統(tǒng)發(fā)育[4], 黃花魚(Miichthys miiuy)消化酶活力[5],歐鱸(Perca fluviatilis)繁殖性能[6], 大菱鲆(Scophthatmus maximus)[7]、條石鯛(Oplegnathus fasciatus)[8]、大西洋鱈魚(Gadus morhua)[9]等魚類的生長(zhǎng)性能。光照周期對(duì)水生動(dòng)物生理生化的影響主要分為2種: 長(zhǎng)光照周期和短光照周期。前者的相關(guān)研究主要集中在光周期的改變對(duì)生長(zhǎng)、存活、免疫等方面的影響[4,10]; 后者主要集中于光周期改變對(duì)激素等的影響, 如光照周期顯著影響了大西洋鮭(Salmo salar)生長(zhǎng)激素的分泌[11], 顯著改變了白斑狗魚(Esox lucius)耗氧率的晝夜節(jié)律[12]。

激素(Hormone)是由高度分化的內(nèi)分泌細(xì)胞合成并直接分泌入血的化學(xué)信息物質(zhì), 它通過調(diào)節(jié)各種組織細(xì)胞的代謝活動(dòng)來影響動(dòng)物的生理活動(dòng), 對(duì)機(jī)體的代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和性別等起重要的調(diào)節(jié)作用。激素不參加具體的代謝過程, 只對(duì)特定的代謝和生理過程起調(diào)節(jié)作用, 調(diào)節(jié)代謝及生理過程的進(jìn)行速度和方向, 從而使機(jī)體的活動(dòng)更適應(yīng)于內(nèi)外環(huán)境的變化。Bj?rn等[11]報(bào)道了大西洋鮭生長(zhǎng)激素(GH)水平受光照周期影響顯著; 田娟等[13]也報(bào)道了饑餓和再投喂顯著影響了尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)血清中GH和類胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的含量, 并影響了其肝胰臟mRNA的表達(dá)豐度。這些研究報(bào)道均表明, 機(jī)體激素的分泌受生長(zhǎng)環(huán)境的影響。

大菱鲆Scophthalmus maximusL., 又名多寶魚,是我國(guó)北方海水工廠化養(yǎng)殖的主要品種之一。在工廠化養(yǎng)殖條件下, 多以白熾燈為光源, 強(qiáng)度與周期均為人為控制。大菱鲆養(yǎng)殖過程中對(duì)光照強(qiáng)度的要求并不嚴(yán)格, 水面光照強(qiáng)度500—6000 lx均可[14], 光照節(jié)律多采用自然光周期, 而在其仔稚魚上的研究表明適當(dāng)延長(zhǎng)光照時(shí)間可促進(jìn)生長(zhǎng)[15]。因此本實(shí)驗(yàn)在適宜的光照強(qiáng)度下, 測(cè)定了4種光照周期對(duì)大菱鲆幼魚攝食、前腸消化酶活力及血清激素含量的變化, 以期為其科學(xué)養(yǎng)殖策略的建立提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與采樣

實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)處理, 分別為24L(光照)∶0D(黑暗,D1)、16L∶8D(D2)、8L∶16D(D3)、0L∶24D(D4), 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)放養(yǎng)體重(30.5±2.0) g的大菱鲆幼魚50尾。實(shí)驗(yàn)在本研究院循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行, 養(yǎng)殖容器為Ф80 cm×H70 cm的綠色PVC水桶, 控制水深為45 cm, 每個(gè)水桶上方加蓋一個(gè)黑色蓋子, 每個(gè)蓋子中間安裝一個(gè)7 W的三基色節(jié)能燈為光源, 采用自動(dòng)計(jì)時(shí)器控制光照周期, 水面光照強(qiáng)度約為1000—1500 lx。在實(shí)驗(yàn)開始前, 實(shí)驗(yàn)魚在養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴養(yǎng)15d, 這期間采用9L∶15D(7:30am—4:30pm)光照周期, 日投喂2次(8:00am,4:00pm)商品飼料(CP≥50%, CL≥10%)。實(shí)驗(yàn)持續(xù)7d, 期間每隔4h飽食投喂1次, 記錄投喂量, 投喂后30min, 排出殘餌數(shù)顆粒計(jì)算重量。實(shí)驗(yàn)第7天時(shí),每次投喂后取樣1次, 每次取3尾魚, 尾靜脈抽血分離血清后, 解剖取前腸, -80℃保存, 共計(jì)取樣6次(8:00am至次日4:00am)。

1.2 樣品測(cè)定與指標(biāo)計(jì)算

腸道蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活力采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定, 蛋白酶測(cè)定采用福林-酚法, 淀粉酶測(cè)定采用碘-淀粉比色法, 脂肪酶測(cè)定采用滴定法。蛋白酶活力單位(U)定義為在pH 8.0, 37℃條件下, 每毫克蛋白質(zhì)中含有的蛋白酶每分鐘使吸光度變化0.003即為一個(gè)酶活力單位。淀粉酶活力單位(U)定義為每毫克蛋白質(zhì)在37℃與底物作用30min, 水解10 mg淀粉定義為1個(gè)淀粉酶活力單位。脂肪酶活力單位(U)定義為在37℃條件下,每克蛋白質(zhì)在本反應(yīng)體系中與底物反應(yīng)1min, 每消耗1 μmol底物為1個(gè)酶活力單位; 勻漿液中蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

血清中生長(zhǎng)激素(GH)、皮質(zhì)醇(COR)、去甲腎上腺素(NE)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)含量采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司酶聯(lián)免疫(Elisa)試劑盒測(cè)定, 具體操作方法見說明書。

攝食率(Feeding rate, %)=日攝食量/體重×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007以及SPSS11.0 One-way ANOVA分析, 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 差異顯著時(shí)(P＜0.05), 用Duncan氏多重比較進(jìn)行。采用SPSS11.0 Two-way ANOVA分析不同光照周期條件下, 不同采樣時(shí)間時(shí)攝食量、消化酶活力及血清激素含量的差異。采用origin8.1繪制血清激素含量變化圖。

2 結(jié)果

2.1 光照周期對(duì)大菱鲆幼魚攝食量的影響

在本實(shí)驗(yàn)中, D2及D3組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中攝食較為正常, 而D1及D4組第2天開始表現(xiàn)為易驚,攝食量下降, 第4天時(shí)有所好轉(zhuǎn), 第6天攝食較為穩(wěn)定。

由表 1可見, 在不同光照周期條件下, 不同采樣時(shí)間時(shí)大菱鲆的攝食量均有差異。在24 L光照下,大菱鲆幼魚每隔8h出現(xiàn)一次攝食高峰, 在16 L及8 L光照下, 實(shí)驗(yàn)魚分別在8:00am及4:00pm出現(xiàn)攝食高峰, 在0 光照下, 實(shí)驗(yàn)魚的攝食量一直呈下降趨勢(shì)。各實(shí)驗(yàn)組的攝食率均隨光照時(shí)間的縮短而降低(P＜0.05), D1組日攝食量比其他三組分別提高了5.59%、13.31%和71.87%。

2.2 光照周期對(duì)大菱鲆幼魚消化酶活力的影響

不同光照周期和采樣時(shí)間時(shí)實(shí)驗(yàn)魚消化酶活力均存在差異(表 2、表 3和表 4)。D1、D2和D3組蛋白酶及淀粉酶活力在12:00am和8:00pm出現(xiàn)2個(gè)峰值, 且8:00pm時(shí)的峰值高于12:00am。D4組酶活呈先降后升趨勢(shì), 但一直維持在較低水平。D1、D2和D3組12:00am至8:00pm脂肪酶活力顯著高于D4組, 其余時(shí)間酶活力無顯著差異, 且0:00am后各組脂肪酶活力變化不顯著。

2.3 光照周期對(duì)大菱鲆幼魚血清激素含量的影響

由表 5可見, 光照周期及采樣時(shí)間時(shí)大菱鲆幼魚血清中GH、COR、NE及T3的含量均存在顯著差異。

實(shí)驗(yàn)期間, 各組實(shí)驗(yàn)魚血清生長(zhǎng)激素(GH)含量均呈先降后升再降低的趨勢(shì), 表現(xiàn)出較強(qiáng)的時(shí)間節(jié)律性(圖 1a)。各組8:00am至8:00pmGH含量無顯著變化, D4組0:00am和4:00am時(shí)GH含量顯著低于其他三組(P＜0.05), D1組4:00am時(shí)GH含量顯著高于其他三組(P＜0.05)。

表 1 光照周期對(duì)大菱鲆幼魚攝食量的影響Tab. 1 The effect of photoperiod on feed consumption of juvenile turbot Scophthalmus maximus L. (g)

表 2 光照周期對(duì)大菱鲆幼魚蛋白酶活力的影響Tab. 2 The effect of photoperiod on protease of juvenile turbot Scophthalmus maximus L. [U/(mg.prot)]

表 3 光照周期對(duì)大菱鲆幼魚淀粉酶活力的影響Tab. 3 The effect of photoperiod on amylase of juvenile turbot Scophthalmus maximus L. [U/(mg.prot)]

由圖 1b可見, D1、D2、D3組初次攝食8h內(nèi)皮質(zhì)醇(COR)含量變化不顯著, 8:00pm時(shí)驟然升高,之后逐漸降低; D4組4:00pm時(shí)含量顯著高于其他組(P＜0.05); D1、D2組8:00pm及0:00am時(shí)顯著高于D3、D4組(P＜0.05); 4:00am時(shí)各組之間差異不顯著(P＞0.05)。

由圖 1c可見, 光照周期顯著影響了大菱鲆幼魚去甲腎上腺素(NE)的含量。8:00am至4:00pm各組NE含量無顯著差異(P＞0.05); D4組實(shí)驗(yàn)魚8:00pm時(shí)顯著高于其他組(P＜0.05); D1、D2組0:00am時(shí)顯著高于其他組(P＜0.05); 4:00am時(shí)各組無顯著差異(P＞0.05)。

D2組8:00am及12:00am時(shí)三碘甲狀原氨酸(T3)含量顯著高于其他組(P＜0.05), D4組8:00pm時(shí)三碘甲狀原氨酸(T3)含量顯著低于其他組, 0:00am顯著高于其他組(P＜0.05), D2、D3組4:00am顯著低于D1、D4組(P＜0.05); 各組T3最高值均出現(xiàn)在8:00pm (圖 1d)。

3 討論

3.1 不同光照周期對(duì)大菱鲆幼魚攝食的影響

光照周期對(duì)魚類的影響可分為短期影響及長(zhǎng)期影響, 魚類攝食節(jié)律的研究方法有分段式投喂法和一次性飽食投喂法。本實(shí)驗(yàn)采用短期分段式投喂研究光照周期對(duì)大菱鲆攝食的影響。在本研究中, 不同光照周期條件下, 各組大菱鲆幼魚均在8:00am出現(xiàn)一個(gè)攝食高峰, D1到D3組在4:00pm時(shí)出現(xiàn)另一個(gè)攝食高峰, 這與鄭珂珂等[16]的研究較為一致, 而D4組攝食量呈一直下降的趨勢(shì), 且由于本實(shí)驗(yàn)中光照強(qiáng)度較弱, 因此可認(rèn)為大菱鲆幼魚屬于典型的晨昏攝食類型。在本實(shí)驗(yàn)中, 隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng), 實(shí)驗(yàn)魚的日攝食量及攝食率均呈上升趨勢(shì),這與在羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergh)及斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)幼體的研究結(jié)果一致[17,18], 光照影響魚類攝食的原因主要有: ①光照能促進(jìn)魚類的活動(dòng), 從而提高其覓食能力; ②光照可能促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌, 從而提高大西洋鮭的食欲[19]。Biswas等[20]研究, 真鯛(Pagrus major)的生長(zhǎng)及飼料利用隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)而增加, 但在大菱鲆[7]及南極石首魚(Argyrosomus japonicu)[21]上的研究表明, 長(zhǎng)期光照對(duì)魚類的生長(zhǎng)及飼料利用的影響是負(fù)面的, 但階段性的提高光照周期可以促進(jìn)魚類的生長(zhǎng)及飼料利用。在本實(shí)驗(yàn)中, 實(shí)驗(yàn)魚對(duì)光照周期改變的適應(yīng)能力較強(qiáng), 且光照會(huì)增加實(shí)驗(yàn)魚的攝食量, 但這種影響能持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間需進(jìn)一步的研究。此外, 實(shí)驗(yàn)魚前期養(yǎng)殖中所采用的管理策略對(duì)其攝食生理造成的影響也需要進(jìn)一步的研究。

表 5 光照周期及采樣時(shí)間對(duì)大菱鲆血清激素含量的主效應(yīng)分析Tab. 5 Main effect analysis of photoperiod and sampling time on serum hormone content in turbot Scophthalmus maximus L.

研究表明自然界中許多魚類的攝食存在晝夜節(jié)律[22], 且不同的光照周期及投喂間隔會(huì)影響某些魚類的攝食量、生長(zhǎng)及飼料利用[23]。因此, 本實(shí)驗(yàn)?zāi)M自然光節(jié)律, 以24h為一個(gè)光照周期, 并采用4h投喂間隔研究光照周期對(duì)大菱鲆攝食量的影響。在本實(shí)驗(yàn)中, D1—D3組日攝食率顯著高于本實(shí)驗(yàn)室其他在相同規(guī)格大菱鲆上的研究[24,25], 表明適當(dāng)加大投喂頻率會(huì)促進(jìn)大菱鲆的攝食。但魚類攝食量的增加會(huì)對(duì)機(jī)體造成的一系列生理生化影響, 這種攝食量的增加是否能長(zhǎng)期維持下去, 有待于進(jìn)一步研究。

3.2 不同光照周期對(duì)大菱鲆幼魚前腸消化酶活力的影響

本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的3種消化酶均為胰酶[26], 胰酶的分泌受神經(jīng)和體液的雙重調(diào)控[27], 并受外部環(huán)境的影響[26,28—30]。在人類上的研究表明, 食物的視覺和味覺可以通過迷走神經(jīng)調(diào)控消化酶分泌, 在魚類上尚未見相關(guān)報(bào)道[31]。消化酶的體液調(diào)控主要是通過胃腸激素激素完成的, 而食物是引起胃腸激素分泌的自然刺激物。與本實(shí)驗(yàn)室其他在大菱鲆上的研究相比, 本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的3種消化酶活力均相對(duì)較高。一方面本實(shí)驗(yàn)是投喂之后取樣, 且取樣間隔時(shí)間較短, 其他研究多在禁食24h后取樣, 由此導(dǎo)致了測(cè)定的消化酶活力有較大變化; 另一方面可能由于光照周期影響了機(jī)體內(nèi)的激素分泌[32], 從而對(duì)其生理節(jié)律造成了影響, 這在斜帶石斑魚上也有類似的報(bào)道[18]。

由于本實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間較短, 缺乏飼料利用、生長(zhǎng)等數(shù)據(jù), 所以不能得出該規(guī)格大菱鲆適宜的最適宜的光照周期及投喂頻率。但從實(shí)驗(yàn)魚的攝食及消化酶活力的變化規(guī)律分析, 12—16h光照、日早晚投喂2次更符合大菱鲆的生理節(jié)律。

圖 1 不同光照周期對(duì)大菱鲆血清激素含量的影響Fig. 1 The effect of different photoperiod on serum hormone contents of turbot Scophthatmus maximus L.

3.3 不同光照周期對(duì)大菱鲆幼魚血清激素含量的影響

脅迫(Stress)是魚類應(yīng)對(duì)環(huán)境改變的一種保護(hù)機(jī)制。環(huán)境脅迫與魚體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)有著廣泛聯(lián)系, 魚體對(duì)環(huán)境脅迫產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)最終結(jié)果是導(dǎo)致其血液激素水平升高[33]。已有研究表明, 血清內(nèi)許多激素的變化是脈沖式[34,35], 單個(gè)時(shí)間取樣所測(cè)的激素水平的平均值難以反映其真實(shí)情況。草魚在正常投喂條件下, 4h左右出現(xiàn)一次生長(zhǎng)激素高峰[35], 因此本實(shí)驗(yàn)采用了4h的取樣時(shí)間。

生長(zhǎng)激素(Growth hormone, GH)是腺垂體細(xì)胞分泌的一種肽類激素。在正常情況下生長(zhǎng)激素呈脈沖式分泌, 受下丘腦產(chǎn)生的生長(zhǎng)激素釋放素(GHRH)和生長(zhǎng)激素抑制激素(GHIH)的調(diào)節(jié), 還受性別、年齡和晝夜節(jié)律的影響[36]。生長(zhǎng)激素的主要生理功能是促進(jìn)神經(jīng)組織以外的所有其他組織生長(zhǎng), 促進(jìn)機(jī)體合成代謝和蛋白質(zhì)合成, 促進(jìn)脂肪分解, 抑制葡萄糖利用而使血糖升高等作用。在本實(shí)驗(yàn)中, 大菱鲆血清GH含量變化呈現(xiàn)出明顯的脈沖性, 且GH含量與曾霖等[37]報(bào)道較為一致。此外,長(zhǎng)期黑暗導(dǎo)致了D4組實(shí)驗(yàn)魚血清GH含量下降, 如果此種情況得以延續(xù), 必然會(huì)導(dǎo)致其生長(zhǎng)性能下降。在本實(shí)驗(yàn)中大菱鲆血清GH峰值出現(xiàn)的時(shí)間與其他動(dòng)物差異較大[32], 這可能與實(shí)驗(yàn)環(huán)境, 尤其是光照強(qiáng)度有關(guān)。

皮質(zhì)醇(Cortisol, COR)是從腎上腺皮質(zhì)中提取出的對(duì)糖類代謝具有最強(qiáng)作用的腎上腺皮質(zhì)激素,是“抗應(yīng)激激素”, 也是水生動(dòng)物中研究最為廣泛的激素[38,39]。在本實(shí)驗(yàn)中, 長(zhǎng)時(shí)間光照(D1、D2組)提高了血清COR含量, 這與大菱鲆對(duì)溫度和鹽度的反應(yīng)較為一致[37,40], 表明短期光照周期的改變對(duì)大菱鲆是一種脅迫環(huán)境。皮質(zhì)醇具有晝夜和季節(jié)變化節(jié)律, 并受光周期、光強(qiáng)度和溫度等環(huán)境因素的影響, 長(zhǎng)期光照對(duì)皮質(zhì)醇影響不顯著[20], 這表明了動(dòng)物對(duì)環(huán)境脅迫的一種適應(yīng)性。相較于黑暗(D4組),光照(D1、D2組)對(duì)大菱鲆血清皮質(zhì)醇的影響更為顯著, 說明長(zhǎng)期光照是比黑暗更為強(qiáng)烈的環(huán)境脅迫。

去甲腎上腺素(Noradrenaline, NE)是腎上腺素去掉N-甲基后形成的物質(zhì), 在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于兒茶酚胺, 它既是一種神經(jīng)遞質(zhì), 也是一種激素。它可以通過α受體激動(dòng), 引起血管極度收縮, 使血壓升高, 冠狀動(dòng)脈血流增加。在本實(shí)驗(yàn)中, 光照僅在8:00pm和0:00am時(shí)對(duì)NE含量有影響, 但并為改變其總體趨勢(shì)。目前關(guān)于水生動(dòng)物去甲腎上腺素的研究較少, 光照改變NE含量的原因尚需進(jìn)一步研究, 但也有可能是由于實(shí)驗(yàn)操作或?qū)嶒?yàn)誤差導(dǎo)致的。

三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine)是由甲狀腺分泌出的活性物質(zhì), 它對(duì)蛋白質(zhì)合成、體溫調(diào)節(jié)、能量產(chǎn)生和調(diào)節(jié)有著極為重要的作用[41]。在異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)上的研究表明,免疫增強(qiáng)劑能提高血清T3、降低COR水平[42]。在本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)此種現(xiàn)象, T3含量表現(xiàn)出較強(qiáng)的規(guī)律性, 延長(zhǎng)光照時(shí)間或長(zhǎng)期黑暗對(duì)其含量有一定影響, 這可能是機(jī)體應(yīng)對(duì)急性脅迫的一種對(duì)策[43]。

在本研究中, 由于采用了短期光照周期, 大菱鲆幼魚攝食、消化酶活力及血清激素含量仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的時(shí)間節(jié)律性, 長(zhǎng)期光照周期對(duì)血清激素時(shí)間節(jié)律的影響仍需進(jìn)一步研究。Imsland等[7]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期光照周期(46個(gè)月)下, 長(zhǎng)期連續(xù)光照降低了大菱鲆的生長(zhǎng), 降低了血清11-甲基睪酮的含量。因此, 在養(yǎng)殖生長(zhǎng)中推薦以8—16h光照周期為宜。

4 結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中, 不同的光照周期顯著影響了大菱鲆幼魚的攝食、消化酶活力及血清激素水平。在此光照強(qiáng)度下, 大菱鲆養(yǎng)殖采取8—16h 光照周期、日投喂2次為宜。