王 鵬 張 弩 張旭杰 張永安

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049;3. 西北工業(yè)大學生命學院, 西安 710072; 4. 華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院, 武漢 430070)

Fc受體(Fc receptor, FcR)是一種表達在免疫細胞膜表面的免疫球蛋白超家族(Immunoglobulins superfamily, IgSF)成員, 它在免疫系統(tǒng)中起著聯(lián)系體液免疫和細胞免疫的作用[1], 其中包括傳統(tǒng)的FcR、多聚免疫球蛋白受體(Polymeric immunoglobulin receptor, pIgR)和Fc受體樣分子(Fc receptor like, FcRL)等[2]?？傮w來說, FcR通過識別免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)的單體或者復合物來激活或者抑制免疫反應[3]。目前在人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)中已經(jīng)鑒定出能識別免疫球蛋白IgG的FcR (FcγR)、IgA的FcR (FcαR)、IgE的FcR(FcεR)、IgM的FcR (FcμR)和IgD的FcR (FcδR)[4—7]。

哺乳動物FcγR大多是以多亞基的復合體形式來發(fā)揮作用, 一般是由α(FcγRα)和γ(FcRγ)亞基組成二聚體結(jié)構(gòu)[3]。FcγR表達在多種細胞類型中, 包括單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和血小板[8—11],在炎癥反應中起到中樞調(diào)節(jié)器的作用。當這些細胞上FcγR的FcγRα亞基與IgG的Fc段結(jié)合時, 信號傳遞給FcRγ亞基, 并通過其胞內(nèi)免疫受體酪氨酸活化基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)上的酪氨酸磷酸化以激活下游信號傳導級聯(lián)反應從而發(fā)揮免疫功能, 實現(xiàn)對體液免疫和細胞免疫的平衡調(diào)控[12—14]。此外, FcγR還參與包括調(diào)理吞噬、介導抗體依賴的細胞毒作用、清除免疫復合物、細胞激活、釋放炎癥因子和活性氧等在內(nèi)的各種細胞免疫反應, 以及參與免疫球蛋白的轉(zhuǎn)運和抗體中和[15—19]?？傊? FcγR參與調(diào)節(jié)多種先天性和適應性免疫反應。在人和小鼠中, 根據(jù)與IgG親和力的不同, FcγR可以分為高親和力的FcγRI (RIA、RIB、RIC)以及低親和力的FcγRII(RIIA、RIIB、RIIC)和FcγRIII (RIIIA、RIIIB), 此外, 在小鼠中還發(fā)現(xiàn)了能特異性識別IgG2a和IgG2b的受體FcγRIV[20—22]。在牛(Bos taurus)、羊(Ovis aries)、豬(Sus scrofa)和馬(Equus caballus)等家畜動物中也有相關FcR被克隆鑒定[23—26], 且表現(xiàn)出了一些特有的序列特征。例如, 在牛中存在的只能特異識別IgG1的FcγR, 在豬中發(fā)現(xiàn)的FcγRIIIA包含有和抗菌肽cathelicidin家族同源的序列[27,28]。另外,也有研究發(fā)現(xiàn)人的郎格罕細胞能表達可溶的FcγR(sFcγRIIA)[29]。

在非哺乳動物的鳥類和兩棲類中也發(fā)現(xiàn)了FcR的同源基因[30,31]。而有關魚類FcγR的研究最近才有相關報道。2000年, Fujiki等[32]首次在鯉(Cyprinus carpio)中發(fā)現(xiàn)跟人和小鼠FcRγ高度同源的分子; 2006年, Stafford等[33]首次在斑點叉尾魚回鮰(Ietalurus punetaus)中克隆得到在結(jié)構(gòu)和功能上跟哺乳動物FcγRα具有同源性的FcRL (IpFcRI), 并且發(fā)現(xiàn)它能夠跟IgM的Fc段特異性結(jié)合。然而迄今為止, 有關虹鱒(Oncorhynchus mykiss)FcγR基因的克隆鑒定尚未見報道。虹鱒屬鮭形目鮭科冷水性魚類, 肉質(zhì)鮮嫩、味美無腥, 無小刺, 蛋白質(zhì)、脂肪和不飽和脂肪酸含量高, 現(xiàn)已被我國列為淡水養(yǎng)殖的優(yōu)良品種[34]。本文以虹鱒為研究對象克隆得到FcγR的α和γ亞基, 研究了其序列和結(jié)構(gòu)特征以及組織和細胞亞群表達分布, 這不僅為研究FcR在脊椎動物中的進化提供了數(shù)據(jù)支持, 也為今后研究虹鱒FcγR的免疫功能奠定了分子基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用的虹鱒來自湖北荊門漳河水庫虹鱒養(yǎng)殖場, 實驗前暫養(yǎng)于中國科學院水生生物研究所控溫樓。虹鱒的具體飼養(yǎng)條件同文獻[35]。

健康狀態(tài)下虹鱒組織樣品的采集取3尾健康虹鱒(50—70) g, 麻醉后依次取血液、頭腎、脾臟、胸腺、后腸、皮膚、鰓、肝臟、心臟、肌肉和腦組織, 液氮中凍存。

誘導狀態(tài)下虹鱒組織樣品的采集將健康虹鱒分為三組, 第一組腹腔注射100 μL無菌PBS, 第二組腹腔注射100 μL LPS (E. coli0111∶B4; 1 mg/mL,溶解于PBS; Sigma-Aldrich), 第三組腹腔注射100 μL poly (I∶C)(1 mg/mL, 溶解于PBS; Sigma-Aldrich)。隨后分別于0、12h、24h、72h和168h各取3尾魚,麻醉后取頭腎組織, 液氮中凍存。

1.2 FcγRα和FcRγ亞基cDNA全長的擴增

RNA的提取與cDNA第一鏈的合成用Trizol試劑(Invitrogen)從上述組織樣品中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 詳細方法見文獻[35]。

FcγRα和FcRγ亞基cDNA中間片段的同源克隆根據(jù)虹鱒的cDNA文庫分別獲得FcγRα和FcRγ亞基的部分cDNA序列, 設計特異性引物(表 1)。以頭腎cDNA為模板分別PCR擴增FcγRα和FcRγ亞基cDNA的中間片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 由武漢擎科生物科技有限公司完成測序[36]。

FcγRα和FcRγ亞基cDNA序列3′-和5′-末端擴增根據(jù)獲得的FcγRα和FcRγ亞基cDNA中間部分序列, 設計特異性引物(表 1)。以頭腎cDNA為模板, 進行RACE-PCR, 獲得3′-和5′-末端序列, 再與中間序列拼接得到全長cDNA序列, 最后在非翻譯區(qū)(Untranslated region, UTR)設計引物(表 1)來驗證拼接的全長cDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、膠回收、連接、轉(zhuǎn)化后將陽性克隆送交擎科公司測序, 具體操作參照本課題組前期研究[36]。

表 1 本文中所用的引物序列Tab. 1 Primers used in the present study

續(xù)表 1

1.3 FcγRα和FcRγ亞基序列的生物信息學分析

利用ExPASy在線翻譯工具(http://web.expasy.org/translate/)將獲得的cDNA序列翻譯成對應的氨基酸序列, 用SignalP 4.1 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號肽, 用TMHMM Server v. 2.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測跨膜區(qū), 用SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域。用ClastalW2.1軟件多重比對氨基酸序列; 使用MEGA 7.0中的鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 自舉置換(Bootstrap)1000次計算各分支的置信度。

1.4 FcγRα和FcRγ亞基基因的表達模式分析

通過CFX ConnectTMReal-Time PCR儀(Bio-Rad)檢測FcγRα和FcRγ基因在虹鱒不同組織和不同細胞亞群中的表達水平,EF-1a基因為內(nèi)參基因, 實時熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)引物的擴增效率及特異性檢測同文獻[37]。qRTPCR體系及程序如下: 稀釋后的cDNA模板4 μL、SsoAdvancedTMSYBR Green Supermix (Bio-Rad)5 μL、250 nmol/L反向引物各0.5 μL, 總反應體系10 μL。擴增反應條件如下: 95℃ 3min, (95℃ 20s、60℃20s、72℃ 20s)45個循環(huán), 最后從65℃到95℃添加溶解曲線。每個組織或細胞樣品設3個重復, 結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算。

1.5 虹鱒頭腎和外周血組織中白細胞亞群的流式分選

用注射器從虹鱒尾靜脈取血后立即用DMEM培養(yǎng)液(添加100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素和 25 U/mL肝素鈉)按照1∶5稀釋; 虹鱒頭腎組織經(jīng)研磨后輕輕穿過尼龍網(wǎng)(網(wǎng)眼直徑為100 mm), 然后用上述DMEM培養(yǎng)液同比例稀釋; 將4 mL細胞懸液緩慢加入連續(xù)Percoll (GE)梯度(34%/51%)上, 4℃400×g在水平轉(zhuǎn)頭上離心30min, 收集頭腎白細胞(Head kidney leukocyte, HKL)和外周血白細胞(Peripheral blood leukocyte, PBL), 加入6 mL含肝素鈉的DMEM培養(yǎng)液洗滌2次。分別加入mouse anti-trout IgM (IgG1亞型)和mouse anti-trout IgT (IgG2b亞型)(一抗), 冰上孵育30min, 小鼠IgG作為陰性對照,然后加入APC-goat anti-mouse IgG1和FITC-goat anti-mouse IgG2b (二抗), 避光在冰上孵育30min,PBS洗滌2次后, 用BD FACSAria Ⅲ流式細胞儀分選髓樣細胞(Myeloid cells, Mye)、IgM+B細胞、IgT+B細胞和雙陰性(Double negative, DN)淋巴細胞, 提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 采用qRT-PCR進行表達分析。具體實驗操作見文獻[38]。

1.6 LPS或poly (I∶C)刺激后頭腎組織中FcγRα和FcRγ基因的表達變化

按照上文方法, 用LPS或poly (I∶C)刺激虹鱒,檢測頭腎中FcγRα和FcRγ基因在不同時間點的表達變化, 分析FcγR是否參與了虹鱒的免疫應答。qRTPCR的引物和流程同1.4, 結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算, 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析(P＜0.05為顯著差異,P＜0.01為極顯著差異)。

2 結(jié)果

2.1 FcγRα和FcRγ基因cDNA序列分析

利用RACE技術克隆得到虹鱒FcγR的α亞基基因FcγRα, 其cDNA (GenBank登錄號: MG993321)全長1667 bp, 包含2個多聚腺苷酸化信號(AATAAA),開放閱讀框(Open reading frame, ORF)為954 bp, 編碼317個氨基酸(Amino acid, aa)。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示它含有一個信號肽(aa1—aa19)和2個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域即D1(aa36—aa117)和D2(aa125—aa200)(圖1A)。虹鱒FcγR的FcRγ亞基具有2種形式, FcRγ1和FcRγ2(包含F(xiàn)cRγ2a和FcRγ2b兩個剪接異構(gòu)體), 其中FcRγ1的cDNA (GenBank登錄號: MG993322)全長為665 bp, ORF為279 bp, 編碼92個aa (圖 1B);FcRγ2a的cDNA (GenBank登錄號: MG993323)全長為701 bp, ORF為342 bp, 編碼113個aa (圖 1C);FcRγ2b的cDNA (GenBank登錄號: MG993324)全長為509 bp, ORF為300 bp, 編碼99個aa (圖 1D)。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示它們均具有信號肽、跨膜區(qū)和胞內(nèi)ITAM基序等特征結(jié)構(gòu)。

2.2 FcγRα和FcRγ同源性比較分析與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

圖 1 虹鱒FcγRIα (A)、FcRγ1 (B)、FcRγ2a (C)和FcRγ2b (D)的cDNA及預測氨基酸序列Fig. 1 cDNA and predicted amino acid sequences of trout FcγRIα (A)、FcRγ1 (B)、FcRγ2a (C) and FcRγ2b (D)

氨基酸序列多重比對硬骨魚類的FcγRα亞基,結(jié)果顯示虹鱒FcγRα與大西洋鮭FcγRα(Salmo salar,ACN10664.1)的相同率最高(85.92%), 與其他硬骨魚類FcγRα相同率為30%—40%。虹鱒FcγRα的信號肽跟其他硬骨魚類的差異較大, D1和D2結(jié)構(gòu)域在不同硬骨魚類間相對較為保守, 且所有硬骨魚類FcγRα都缺失跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)(圖 2A)。虹鱒FcRγ各亞型中, FcRγ1與其余2個亞型的氨基酸序列相同率分別為40.98%和45.37%(表 2), 而FcRγ2b相比FcRγ2a僅缺失14個氨基酸(圖 2B); 氨基酸序列多重比對顯示, FcRγ的跨膜區(qū)和ITAM區(qū)在硬骨魚類中非常保守, 虹鱒FcRγ1氨基酸序列與其他硬骨魚類以及人類的同源序列的相同率為38.83%—42.57%(圖 2B)。

系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示, 硬骨魚類的FcγRα聚為一支, 哺乳動物的FcγRα聚為另一支, 且虹鱒與大西洋鮭的親緣關系最近, 這與其分類地位一致(圖 3A)。用不同類型的FcRγ構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖 3B), 結(jié)果表明虹鱒FcRγ與斑馬魚(Danio rerio)、鯉(Cyprinus carpio)和鲇(Silurus asotus)等硬骨魚類親緣關系較近, 而與哺乳動物的親緣關系較遠, 此外虹鱒FcRγ2a和FcRγ2b聚為一亞支, 而虹鱒FcRγ1與斑馬魚的同源序列聚為另一亞支(圖 3B)。

2.3 FcγRα和FcRγ基因在虹鱒組織和細胞中的表達分析

虹鱒FcRγ存在FcRγ1和FcRγ2兩種形式, 其基因分別位于9號和8號染色體上, FcRγ2a和FcRγ2b是FcRγ2基因轉(zhuǎn)錄表達的不同剪接異構(gòu)體(圖 4)。與FcRγ2a相比, FcRγ2b在其ITAM基序前面僅缺失14個氨基酸殘基(圖 2B), 因此我們只能采用一對qRT-PCR引物來檢測FcRγ2a和FcRγ2b的共表達模式。結(jié)果顯示FcRγ1在各組織中表達量最高, 其次是FcRγ2a/2b, 且FcRγ1和FcRγ2a/2b在淋巴組織中的表達量要顯著高于非淋巴組織, 其中脾臟表達量最高, 其次是頭腎和外周血; 而FcγRα僅在外周血、頭腎和脾臟等淋巴組織中有較高表達, 其余組織僅有微弱表達(圖 5)。

圖 2 虹鱒FcγRα與其他魚類相應分子氨基酸序列比對(A)和虹鱒FcRγ與其他物種相應分子氨基酸序列比對(B)Fig. 2 Amino acid alignment of trout FcγRα with the related sequences in other fish (A); Amino acid alignment of trout FcRγ with the related sequences in other species (B)

表 2 虹鱒FcRγ各亞型間氨基酸序列相同率Tab. 2 Amino acid sequence identity between the subunit of FcRγ in rainbow trout

圖 3 脊椎動物FcγRα(A)和FcRγ(B)氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig. 3 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of vertebrate FcγRα (A) and FcRγ (B)

采用流式細胞術從虹鱒PBL和HKL中分選得到IgM+B細胞群、IgT+B細胞群、DN淋巴細胞群和Mye細胞群。qRT-PCR結(jié)果顯示,FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b均在Mye細胞群中表達量最高,其次是DN細胞群, 在IgM+和IgT+B細胞群僅有少量表達; 在Mye細胞群中FcRγ1表達量最高, 在DN淋巴細胞群中FcRγ2a/2b表達量最高(圖 6)。

2.4 Poly (I∶C)或LPS刺激后頭腎組織中FcγRα和FcRγ基因表達分析

圖 4 虹鱒FcRγ1(A)基因預測結(jié)構(gòu)示意圖和FcRγ2(B)基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的預測結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 4 A schematic diagram shows the predicted geneorganization of FcRγ1 (A) and FcRγ2 (B) and the transcripts of FcRγ2

圖 5 虹鱒FcγR基因的組織表達分布Fig. 5 Expression patterns of FcγR in different tissues of rainbow trout

圖 6 虹鱒頭腎白細胞(A)和外周血白細胞(B)各亞群FcγR基因的表達分布Fig. 6 Expression patterns of FcγR in the cell subpopulations of trout head kidney leukocytes (HKL, A) and trout peripheral blood leukocytes (PBL, B)

LPS是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分, 它能在動物體內(nèi)引起強烈的免疫反應。為了研究FcγR基因在虹鱒抗細菌過程中的免疫作用, 我們采用qRT-PCR檢測了虹鱒受LPS刺激后不同時間點FcγRα和FcRγ基因在頭腎組織中的表達變化情況。結(jié)果顯示, 受LPS刺激后FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b基因在頭腎中均呈現(xiàn)先上調(diào)后下降的表達趨勢。其中FcγRα在刺激12h后表達量開始升高, 并在24h達到峰值(P＜0.05); 與對照組相比,FcRγ1在刺激12h后表達量有所升高, 但相比對照組其差異并不顯著;FcRγ2a/2b在刺激12h后表達量顯著升高(P＜0.05), 在24h達到峰值; 所有基因的表達在刺激168h后開始呈現(xiàn)下降趨勢并逐漸恢復到正常水平(圖 7A)。

作為雙鏈RNA的類似物, Poly (I∶C)可以模擬病毒感染, 誘導機體產(chǎn)生抗病毒的免疫反應。qRTPCR結(jié)果顯示poly (I∶C)可以誘導FcγRα、FcRγ1和FcRγ2a/2b基因的表達, 其中FcγRα的表達在刺激12h后顯著上調(diào)(P＜0.05)并在24h達到峰值, 在刺激72h后開始下調(diào);FcRγ1和FcRγ2a/2b的表達在刺激12h后達到峰值(P＜0.05), 24h后下調(diào)到正常水平(圖 7B)。

3 討論

圖 7 虹鱒頭腎組織中FcγR基因在LPS (A)或poly (I∶C)(B)刺激下不同時間點的表達水平Fig. 7 Expression analysis of FcγR in the head kidney for trout stimulated with LPS (A) or Poly (I∶C) (B)

哺乳動物Fc受體FcγR是由FcγRα和FcRγ亞基以非共價鍵形式形成聚合物發(fā)揮免疫功能的[39]。在本研究中, 我們克隆了虹鱒FcγR的FcγRα和FcRγ亞基的cDNA序列。虹鱒的FcγRα亞基由2個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成, 沒有跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū),暗示本研究獲得的虹鱒FcγRα亞基很可能是一種分泌型的可溶蛋白?？扇苄缘腇cR (Soluble Fc receptor, sFcR)是通過mRNA的選擇性剪切或者細胞膜型FcR通過蛋白酶解作用產(chǎn)生[40]。在哺乳動物中,sFcR不僅可以阻遏抗體復合物與膜表面表達FcR的細胞的結(jié)合, 下調(diào)B細胞的增殖和抗體分泌, 還可以通過結(jié)合補體受體來激活細胞[41—43]。在斑點叉尾鮰血清中用多克隆抗體可以檢測到FcR蛋白, 證實了sFcR在硬骨魚類中也存在[33], 由此推斷虹鱒FcγRα亞基或許可以形成sFcR, 從而發(fā)揮免疫作用。氨基酸序列比對結(jié)果顯示硬骨魚類FcγRα亞基的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域相似度很高, 表明硬骨魚類FcγRα亞基在進化中十分保守。與此同時, 本研究還鑒定了虹鱒FcRγ亞基的2種亞型, 它們均具有信號肽、跨膜區(qū)及胞內(nèi)ITAM基序。氨基酸序列比對結(jié)果顯示虹鱒FcRγ亞基與代表性脊椎動物的FcRγ亞基相似度非常高, 表明FcRγ亞基在進化中非常保守。

FcγRα基因主要在虹鱒的淋巴組織中表達, 而在非淋巴組織中的表達水平明顯較低, 比如心臟、腮、肝臟和肌肉, 其組織表達模式與已報道的斑點叉尾鮰的FcR基因的表達模式[33]基本一致, 表明FcγRα可能在魚類免疫系統(tǒng)中扮演重要角色。FcRγ基因在虹鱒各組織中的表達水平都要高于FcγRα基因, 這可能與FcRγ也可作為其他FcR (如FcαR、FcεR和FcμR等)的亞基以及激活信號元件有關[44]。FcRγ1基因在大部分淋巴組織中的表達水平均高于FcRγ2a/2b基因, 表明FcRγ1可能在虹鱒免疫系統(tǒng)中具有更廣泛的作用。在人和小鼠中,FcγR基因主要在樹突狀細胞、單核細胞和巨噬細胞以及絕大多數(shù)的中性粒細胞中表達, 而不在淋巴細胞中表達[45], 而有關硬骨魚類FcγR的表達細胞類型卻甚少報道。本研究結(jié)果表明虹鱒的FcγR基因主要表達在頭腎和外周血的髓樣細胞(包含樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等)中,其表達細胞類型和哺乳動物中相似。

在硬骨魚類中, 頭腎被認為是類似于哺乳動物骨髓的中樞免疫器官, 在免疫系統(tǒng)中起重要作用[46]。在本研究中, LPS和Poly (I∶C)刺激后虹鱒FcγRα基因在頭腎中的表達水平顯著上調(diào), 預示FcγRα在魚類抗細菌和抗病毒免疫過程中發(fā)揮重要作用[47]。FcRγ1和FcRγ2a/2b基因在頭腎中的表達在受刺激后12h也達到峰值, 表明魚類FcRγ亞基可能通過ITAM參與了抗細菌和抗病毒免疫信號的傳導過程。

總而言之, 本研究克隆的虹鱒Fc受體FcγR的亞基基因(FcγRα和FcRγ)廣泛表達于各種組織中, 特別是包括外周血、頭腎和脾臟在內(nèi)的淋巴組織中。此外, 從頭腎和外周血白細胞中分選得到的亞細胞群中, FcγR的亞基基因主要表達在髓樣細胞群, 而且在受到LPS和Poly (I∶C)刺激后虹鱒頭腎組織中FcγR的亞基基因的上調(diào)表達說明該基因參與了抗細菌和抗病毒的免疫反應。然而, 虹鱒FcγR在細胞和體液免疫中的具體功能還需要進一步探究。