李小坤，王旺，林影，梁書(shū)利

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

核糖核酸(Ribonucleicacid，RNA)是一類(lèi)重要的生物大分子，它不僅在基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的生物合成中起著關(guān)鍵的作用，而且還能促進(jìn)細(xì)胞的諸多生理功能[1]。核糖核酸降解后得到的核苷酸、核苷及堿基用途廣泛。5’-核苷酸可作為增味劑應(yīng)用于食品工業(yè)，而它主要來(lái)源是 RNA[2,3]。目前，絕大部分生產(chǎn)核糖核酸的企業(yè)是利用經(jīng)誘變篩選后的產(chǎn)朊假絲酵母或熱帶假絲酵母等發(fā)酵提取得到核糖核酸[4]。解脂假絲酵母為念珠菌的一種，念珠菌是引起全身性念珠菌感染的主要致病原，至今為止仍不能完全說(shuō)明假絲酵母對(duì)人畜健康無(wú)害。而釀酒酵母是最早人類(lèi)認(rèn)識(shí)和利用微生物之一，幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，釀酒酵母被用于食品和酒精飲料生產(chǎn)[5]。

應(yīng)用常壓室溫等離子體（ARTP）技術(shù)進(jìn)行誘變育種[6]。等離子體（Plasma）是與物質(zhì)的固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)并存的物質(zhì)第四態(tài)，是一種正離子和電子密度大致相等的電離氣體，具有導(dǎo)電、發(fā)光、化學(xué)性質(zhì)活潑以及分布廣等特點(diǎn)[7]。均勻的等離子體射流作用于細(xì)胞，可引發(fā)種類(lèi)豐富的DNA損傷，獲得大量突變庫(kù)[8]。到目前為止，ARTP誘變育種儀已經(jīng)成功應(yīng)用于包括細(xì)菌、真菌、微藻在內(nèi)的多種微生物，并且突變率和正突變率均較高，突變株遺傳穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點(diǎn)[9]。

本研究以從環(huán)境中分離得到的菌株 Y17作為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行反復(fù)多次ARTP等離子誘變，利用氯化鉀敏感篩選得到核酸含量提高的突變菌株Y17aM3，然后對(duì)突變菌株進(jìn)行生理生化特性分析，并進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化及傳代穩(wěn)定性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

野生釀酒酵母釀酒酵母Y17均由廣東江門(mén)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中心有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基與溶液

麥芽汁培養(yǎng)基：購(gòu)買(mǎi)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，稱(chēng)取130.1 g產(chǎn)品溶解于1000 mL蒸餾水中，攪拌至完全溶解，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基：葡萄糖 0.1%、KCl 0.18%、NaAC 0.82%、酵母浸膏0.25%、瓊脂2%，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

碳源同化試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、CaCl20.01%、NaCl 0.01%、酵母浸膏0.02%、糖或其它碳源2%，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

氮源同化試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、酵母浸膏0.02%，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

糖蜜酸化液：80 g糖蜜加120 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍昧蛩嵴{(diào)節(jié)pH 4.0～4.3，90～95 ℃水浴并不斷攪拌15 min，4000 r/min離心10 min，取上清。

糖蜜培養(yǎng)基：上述糖蜜酸化液加水至1000 mL，加3%營(yíng)養(yǎng)液并調(diào)pH至4.8，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

營(yíng)養(yǎng)液：85%磷酸 4.55%、硫酸銨 25%、尿素12.5%、硫酸鎂1.25%。

1.2 儀器與設(shè)備

購(gòu)于江蘇無(wú)錫源清天木生物科技有限公司的ARTP誘變育種儀；UV-5200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

1.3.1.1 菌種活化

用無(wú)菌牙簽從保種管中蘸取菌液于麥芽汁平板上劃線，在30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d。

1.3.1.2 搖瓶種子培養(yǎng)

從麥芽汁平板上挑取單菌落接種于裝有10 mL麥芽汁培養(yǎng)基的 50 mL三角瓶中，在柜式旋轉(zhuǎn)搖床上30 ℃，250 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.1.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

按5%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接于裝有100 mL糖蜜培養(yǎng)基的 500 mL三角瓶中，在柜式旋轉(zhuǎn)搖床上30 ℃，250 r/min培養(yǎng)18 h。

1.3.2 RNA含量測(cè)定方法

收集并洗凈發(fā)酵培養(yǎng)后的釀酒酵母，稱(chēng)取一定重量菌體，采用高氯酸法[2,10]測(cè)定RNA含量。RNA含量的計(jì)算公式如下：

式中：OD260是紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于260 nm測(cè)得的吸光值，W干重是樣品的干重。

1.3.3 釀酒酵母單倍體分離

釀酒酵母在麥芽汁培養(yǎng)基中經(jīng)二級(jí)活化后于麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基平板上劃線，28 ℃培養(yǎng)。每天進(jìn)行子囊孢子染色并鏡檢，觀察釀酒酵母產(chǎn)孢情況[11]。產(chǎn)孢率較高時(shí)（5～7 d左右），采用文獻(xiàn)[12]進(jìn)行釀酒酵母單倍體分離。將單倍體分離后得到的菌液適當(dāng)稀釋?zhuān)坎加邴溠恐囵B(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，最后PCR鑒定單倍體菌株[13]。

1.3.4 ARTP誘變育種

參考文獻(xiàn)[14,15]進(jìn)行ARTP誘變育種，分別設(shè)定了菌懸液誘變的處理時(shí)間為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 s，統(tǒng)計(jì)不同處理時(shí)間下菌株的致死率。致死率計(jì)算公式如下：

式中：T是樣品在未經(jīng)ARTP處理時(shí)的總菌落數(shù)，A是樣品在ARTP處理后存活的的菌落數(shù)。

1.3.5 篩選方法

采用KCl敏感篩選高核酸突變菌株[16]。誘變處理后培養(yǎng)2～3 d，影印到含一定濃度KCl的麥芽汁培養(yǎng)基平板，篩選出對(duì)KCl敏感的突變株，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)并測(cè)定RNA含量。

1.3.6 生理生化特性

參考文獻(xiàn)[17]進(jìn)行釀酒酵母培養(yǎng)特征和細(xì)胞形態(tài)觀察、碳源同化試驗(yàn)、氮源同化試驗(yàn)、耐糖性、耐酸性以及耐鹽性等一系列生理生化特性分析。

1.3.7 發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化

參考文獻(xiàn)[18]進(jìn)行釀酒酵母培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，包括接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度、氮源和無(wú)機(jī)鹽，確定最適的培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基成分。

1.3.8 傳代試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行傳代試驗(yàn)，將釀酒酵母突變菌株Y17aM3連續(xù)傳代培養(yǎng)至10代。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)研究過(guò)程中所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，本研究所采用的統(tǒng)計(jì)量為標(biāo)準(zhǔn)差[20]。標(biāo)準(zhǔn)差是是各數(shù)據(jù)偏離平均數(shù)的距離的平均數(shù)，是離均差平方和平均后的方根，用公式表示為：

式中：數(shù)值 X1，X2，X3……XN(皆為實(shí)數(shù))，其算術(shù)平均值為μ，標(biāo)準(zhǔn)差為σ。

2 結(jié)果與討論

2.1 釀酒酵母單倍體分離

用光學(xué)顯微鏡觀察釀酒酵母產(chǎn)孢情況結(jié)果如圖1，圖中綠色的為子囊孢子，紅色的為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。由圖可看出細(xì)胞形成子囊孢子的數(shù)量并不都相同，其中形成2個(gè)和3個(gè)子囊孢子相對(duì)較多，能形成4個(gè)子囊孢子非常少。

圖1 釀酒酵母Y17的子囊孢子Fig.1 The ascospores of Saccharomyces cerevisiae Y17

圖2 釀酒酵母Y17單倍體配型PCR鑒定Fig.2 Identification of the haploid types of Saccharomyces cerevisiae Y17 by PCR

釀酒酵母的交配型是由位于酵母染色體Ⅲ上MAT座控制的，MAT座上的兩個(gè)等位基因MATa和MATα大約相差100 bp[21]。PCR產(chǎn)物僅有一條544 bp條帶的為a型單倍體，PCR產(chǎn)物僅有一條404 bp條帶的為α型單倍體，兩條產(chǎn)物都有的為二倍體[22]。如圖2，得到4株Y17a型單倍體，3株Y17α型單倍體。兩種交配型單倍體分別挑取3株與原始出發(fā)菌株Y17同時(shí)培養(yǎng)測(cè)定RNA含量，結(jié)果如圖3。兩種配型單倍體RNA含量分配不均，a型單倍體RNA含量比α型單倍體約高50%。

圖3 釀酒酵母Y17單倍體RNA含量Fig.3 The RNA content of haploid of Saccharomyces cerevisiae Y17

2.2 ARTP誘變育種

以RNA含量最高的a型單倍體為出發(fā)菌株進(jìn)行ARTP誘變，致死率和誘變處理時(shí)間關(guān)系如圖 4。選擇誘變效應(yīng)最強(qiáng)即致死率90%～95%的55 s進(jìn)行反復(fù)誘變[23]，最終得到一株RNA含量比原始出發(fā)菌株Y17高39%突變菌株Y17aM3（如圖5）。將Y17aM3在糖蜜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從第6 h開(kāi)始每隔2 h取一次樣，得到Y(jié)17aM3生長(zhǎng)及產(chǎn)RNA曲線如圖6。由圖6可知，發(fā)酵培養(yǎng)至12 h之前，酵母生長(zhǎng)和RNA含量都隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而增加；12～18 h酵母生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期，而RNA含量在18 h時(shí)最高；18 h之后，酵母生長(zhǎng)處于衰亡期，RNA含量隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而降低。

圖4 致死率和誘變處理時(shí)間關(guān)系Fig.4 The relationship between lethality rate and time of mutagenesis

圖5 突變菌株RNA含量Fig.5 The RNA content of Mutant strains

圖6 突變菌株Y17aM3生長(zhǎng)及生產(chǎn)RNA曲線Fig.6 The growth and RNA production of mutant strain Y17aM3

2.3 釀酒酵母生理生化實(shí)驗(yàn)

2.3.1 形態(tài)特征

將Y17aM3和Y17進(jìn)行培養(yǎng)并誘導(dǎo)產(chǎn)孢，觀察菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征，并在油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和產(chǎn)孢情況。結(jié)果如圖7和表1。Y17aM3和Y17細(xì)胞形態(tài)均為檸檬形，菌落均為乳白色、有光澤、邊緣整齊，無(wú)性繁殖方式均為出芽生殖，液體培養(yǎng)均產(chǎn)生白色沉淀。Y17aM3為單倍體，不能產(chǎn)生子囊孢子。Y17aM3的形態(tài)特征與Y17一致，符合釀酒酵母基本形態(tài)特征。

圖7 釀酒酵母的形態(tài)特征觀察Fig.7 Observation on the morphological characteristics of Saccharomyces cerevisiae

表1 釀酒酵母形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of Y17aM3

表 2釀酒酵母糖發(fā)酵結(jié)果Table 2 The results of Saccharomyces cerevisiae to ferment sugars

2.3.2 糖發(fā)酵試驗(yàn)

對(duì)Y17aM3和Y17進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)，Y17W和Y17aM3均能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、半乳糖、可溶性淀粉、棉子糖，均不能夠發(fā)酵糊精、木糖、木聚糖、乳糖、鼠李糖、纖維二糖、甘露醇、菊糖、木糖醇，與菌種鑒定手冊(cè)中釀酒酵母糖類(lèi)發(fā)酵結(jié)果一致。

2.3.3 碳源同化試驗(yàn)

對(duì)Y17aM3和Y17進(jìn)行碳源同化試驗(yàn)，結(jié)果如圖8。對(duì)比了兩株菌同化碳源的能力，發(fā)現(xiàn) Y17aM3對(duì)葡萄糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、菊糖的同化能力稍有降低，而幾乎喪失了對(duì)半乳糖的同化能力，但對(duì)糊精特別是乳糖的同化能力提高了，而Y17幾乎沒(méi)有同化乳糖的能力。

圖8 Y17和Y17aM3碳源同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.8 The results of carbon source assimilation of Y17 and Y17aM3

2.3.4 氮源同化試驗(yàn)

對(duì)Y17aM3和Y17進(jìn)行碳源同化試驗(yàn)，結(jié)果如圖9。Y17aM3除了對(duì)大豆蛋白胨的同化能力提高了，對(duì)其余幾種氮源同化能力與Y17出發(fā)菌大致相同。因此在糖蜜培養(yǎng)基中加入大豆蛋白胨可以促進(jìn)Y17aM3的生長(zhǎng)。

圖9 Y17和Y17aM3氮源同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.9 The results of nitrogen source assimilation of Y17 and Y17aM3

2.3.5 耐糖性

葡萄糖對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖10-a。在低濃度的葡萄糖中都能良好生長(zhǎng)，當(dāng)葡萄糖濃度＞5%時(shí)，Y17aM3的生長(zhǎng)隨葡萄糖濃度的增加而減慢；當(dāng)葡萄糖濃度為60%時(shí)，Y17aM3的生長(zhǎng)完全被抑制。

2.3.6 耐酸性

麥芽汁培養(yǎng)基初始pH對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖10-b。當(dāng)pH為3.5～5.5時(shí)，Y17aM3的生長(zhǎng)隨初始pH的增大而逐漸加快；當(dāng)pH=5.5時(shí)，Y17aM3生長(zhǎng)最快；當(dāng)pH＞5.5時(shí)，Y17aM3的生長(zhǎng)明顯減慢。因此，Y17aM3的最適生長(zhǎng)pH為5.5。

2.3.7 耐糖性

培養(yǎng)基中鹽濃度的變化可以影響酵母的好氧量、生長(zhǎng)速度以及發(fā)酵率等方面的生理功能。麥芽汁培養(yǎng)基中KCl對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖10-c。隨著KCl濃度的增加，Y17aM3的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，當(dāng)KCl濃度達(dá)160 g/L時(shí)，Y17aM3基本不生長(zhǎng)。

圖10 葡萄糖、初始pH和KCl對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)的影響Fig.10 The effect of glucose, initial pH and KCl on the growth of Y17aM3

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化

2.4.1 最適接種量確定

研究了接種量對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)及生產(chǎn)RNA的影響，結(jié)果如圖11。隨著接種量逐漸增加，Y17aM3生產(chǎn)RNA含量逐漸提高，大于10%時(shí)Y17aM3生產(chǎn)RNA含量逐漸降低。因此最適接種量為10%，此時(shí)Y17aM3生長(zhǎng) OD600最高為 15，RNA產(chǎn)量最高達(dá)到 112 mg-RNA/g-DCW。

圖11 接種量對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)及生產(chǎn)RNA影響Fig.11 The effect of inoculation on the growth and RNA production of Y17aM3

2.4.2 最適初始pH確定

pH對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)代謝有重要影響作用，研究了pH對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)及生產(chǎn)RNA的影響，結(jié)果如圖12。初始pH為3.5～5.5時(shí)，Y17aM3隨著初始pH升高而生長(zhǎng)加快及RNA產(chǎn)量增加，初始pH為5.5～7時(shí)，Y17aM3隨著初始pH升高而生長(zhǎng)減慢及RNA產(chǎn)量減少。因此，最適初始pH為5.5，此時(shí)Y17aM3生長(zhǎng)OD600最高為 14，RNA產(chǎn)量最高為 112 mg-RNA/g-DCW。

圖12 初始pH對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)及生產(chǎn)RNA影響Fig.12 The effect of initial pH on the growth and RNA production of Y17aM3

2.4.3 最適溫度確定

適合的溫度有利于釀酒酵母更好的生長(zhǎng)代謝，研究了溫度對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)及生產(chǎn)RNA的影響，結(jié)果如圖 13。Y17aM3隨著培養(yǎng)溫度升高而生長(zhǎng)減慢及RNA產(chǎn)量減少，因此低溫更有利于Y17aM3生長(zhǎng)和積累RNA。最適溫度為26 ℃，此時(shí)Y17aM3生長(zhǎng)OD600最高為14.5，RNA含量最高為115 mg-RNA/g-DCW，比在30 ℃條件下提高了3 mg-RNA/g-DCW。

圖13 培養(yǎng)溫度對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)及生產(chǎn)RNA影響Fig.13 The effect of culture temperature on the growth and RNA production of Y17aM3

2.4.4 氮源對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)和生產(chǎn)RNA的影響

氮源是微生物生長(zhǎng)過(guò)程中不可或缺的營(yíng)養(yǎng)元素[24]，其主要功能是合成含氮物質(zhì)。研究幾種氮源對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)及生產(chǎn)RNA的影響，結(jié)果如圖14。添加大豆粉能明顯促進(jìn)Y17aM3的生長(zhǎng)，生長(zhǎng)OD600由14提高至14，但是對(duì)酵母生產(chǎn)RNA沒(méi)有明顯促進(jìn)作用；添加酵母提取物也能明顯促進(jìn)Y17aM3的生長(zhǎng)，生長(zhǎng)OD600由14提高至17，且RNA含量提高至119 mg-RNA/g-DCW，提高了7 mg-RNA/g-DCW；其中蛋白胨對(duì)Y17aM3的生長(zhǎng)和生產(chǎn)RNA促進(jìn)作用最明顯，生長(zhǎng) OD600由 14提高至 17，RNA含量提高至 122 mg-RNA/g-DCW，提高了10 mg-RNA/g-DCW。

圖14 氮源對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)及生產(chǎn)RNA影響Fig.14 The effect of nitrogen source on the growth and RNA production of Y17aM3

2.4.5 無(wú)機(jī)鹽對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)和生產(chǎn)RNA的影響

無(wú)機(jī)鹽是微生物生長(zhǎng)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)微生物合成RNA有重要意義[25]。研究了幾種無(wú)機(jī)鹽對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)及生產(chǎn)RNA的影響，結(jié)果如圖15。只有磷酸對(duì)Y17aM3生產(chǎn)RNA促進(jìn)作用最明顯，RNA含量提高至 119 mg-RNA/g-DCW，提高了 7 mg-RNA/g-DCW，而對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)作用亦沒(méi)有抑制作用。

圖15 無(wú)機(jī)鹽對(duì)Y17aM3生長(zhǎng)及生產(chǎn)RNA影響Fig.15 The effect of inorganic salt on the growth and RNA production of Y17aM3

2.5 釀酒酵母突變菌株 Y17aM3的傳代穩(wěn)定性分析

應(yīng)用物理化學(xué)方法進(jìn)行菌種選育得到的突變菌株包含很多隱性突變，且突變性狀不穩(wěn)定容易發(fā)生回復(fù)突變，因此對(duì)篩選得到的突變菌株進(jìn)行傳代試驗(yàn)驗(yàn)證傳代穩(wěn)定性是非常必要的[19]。將突變菌Y17aM3連續(xù)傳代培養(yǎng)至10代，培養(yǎng)并測(cè)定RNA含量，結(jié)果如圖16。傳代至10代，生長(zhǎng)OD600穩(wěn)定在14.6～15.0之間，RNA含量穩(wěn)定在109～112 mg-RNA/g-DCW之間，變化幅度非常小，因此說(shuō)明經(jīng)過(guò)ARTP誘變得到的突變菌Y17aM3傳代穩(wěn)定性良好，不易發(fā)生回復(fù)突變。

圖16 Y17aM3傳代及其生長(zhǎng)和RNA含量Fig.16 The growth and RNA content of Y17aM3 passages

3 結(jié)論

由于 ARTP誘變對(duì)生物的遺傳物質(zhì)損傷效果明顯、損傷機(jī)制豐富，尤其是對(duì)于染色體等真核生物的遺傳物質(zhì)均有很強(qiáng)的損傷效果[26]。本研究通過(guò)ARTP誘變選育獲得了在以糖蜜為碳源的搖瓶試驗(yàn)中 RNA含量比原始出發(fā)菌株 Y17提高了 39%突變菌Y17aM3，經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化后，RNA含量最高可達(dá)122 mg-RNA/g-DCW，達(dá)到目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高水平[2]。要實(shí)現(xiàn)工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)，還需要進(jìn)一步改進(jìn)，比如發(fā)酵罐流加條件的細(xì)化及核酸代謝動(dòng)力學(xué)的建立等。釀酒酵母RNA含量的大幅度提高，將大大降低食品工業(yè)中添加劑的生產(chǎn)成本以及增加經(jīng)濟(jì)效益。在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的誘變方法相比，ARTP能夠有效造成DNA多樣性的損傷，突變率高，并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株，將為工業(yè)微生物的系統(tǒng)改造提供儀器和方法平臺(tái)，有望成為現(xiàn)代生物技術(shù)的通用工具。