吳超，王慧，張曉偉，秦海蘭，周興華，趙延勝,

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

（2.鎮(zhèn)江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心，江蘇鎮(zhèn)江 212000）

L-阿拉伯糖又稱L-樹膠醛糖、果膠糖，其形態(tài)為白色結晶，對熱和酸穩(wěn)定，廣泛存在于植物中如玉米皮、甘蔗渣[1]。L-阿拉伯糖具有很強的非競爭性抑制蔗糖吸收的功能，能夠減少吸收蔗糖帶來的血清中葡萄糖濃度升高,其甜度是蔗糖的一半，可作為一種新型的低熱量功能型甜味劑[2]。已有研究表明，L-阿拉伯糖具有調(diào)節(jié)血糖吸收、降脂、促進腸道消化排毒、防止齲齒等功效[3]，近年來不斷被開發(fā)應用。

秀麗隱桿線蟲是一種重要的模式生物，以大腸桿菌OP50為食。它具有結構簡單、身體透明、易于觀察、生命周期短、子代數(shù)目多等生物學特征[4]，并與人類脂肪代謝路徑相似，各關鍵步驟的酶相似度較高[5]。通過線蟲的生理生化研究，有助于闡明并揭示食品中功能活性成分對健康的影響及作用機制。L-阿拉伯糖作為一種食品中重要的代糖來源，目前在模式生物線蟲中的研究較少。因此，本試驗擬通過研究 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲生長發(fā)育和脂肪合成能力的影響，為進一步探索開發(fā)其功能活性，并揭示其健康作用機制提供理論和試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秀麗隱桿線蟲N2野生型、大腸桿菌OP50由東南大學王大勇實驗室惠贈；L-阿拉伯糖由山東漢糖生物科技有限公司提供；甘油三酯檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；油紅O儲備液、瓊脂粉、NaCl粉末、胰蛋白胨、CaCl2、MgSO4、膽固醇、葡萄糖粉末、異丙醇均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試劑的配制

線蟲裂解液：10%的次氯酸鈉和1 mol/L的氫氧化鈉按照1：1的比例混合，搖勻得到裂解液。M9緩沖液：稱取KH2PO4粉末3 g、Na2HPO4粉末6 g、NaCl粉末5 g于錐形瓶內(nèi)，量取1 mL的1 mol/L硫酸鎂溶液加入，然后在磁力攪拌器上加水至1 L，高壓滅菌后分裝使用。油紅O染液：油紅O儲備液與蒸餾水3：2混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。上述配制的溶液均需過濾除菌。

1.3 主要儀器設備

體視顯微鏡，南京江南永新光學有限公司；多功能酶標儀，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；生化培養(yǎng)箱，上?？茖W儀器有限公司；高速離心機，江蘇捷達離心機制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上?？茖W儀器有限公司；高壓滅菌鍋，帝肯（上海）貿(mào)易有限公司；電子天平，沈陽科瑞永興化玻儀器有限公司；一次性培養(yǎng)皿，青島金典生化器材有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 含糖培養(yǎng)基的配制

（1）線蟲生長培養(yǎng)基（Nematode Growth Media，NGM）的配制參照Brenner等[6]的方法：稱取氯化鈉3 g、瓊脂粉17 g、胰蛋白胨2.5 g于錐形瓶中，加入975 mL蒸餾水混勻封口后放入高壓滅菌鍋內(nèi)121 ℃滅菌50 min，待培養(yǎng)液溫度降至60 ℃，依次加入1 mL濃度為1 mol/L的CaCl2、1 mL濃度為1 mol/L的MgSO4、1 mL濃度為5 mg/mL的膽固醇、以及25 mL濃度為1 M的K3PO4緩沖液，混勻后倒入無菌塑料培養(yǎng)皿。

（2）含葡萄糖的NGM培養(yǎng)基：將1 mol/L葡萄糖母液按照1：1000的比例加入NGM培養(yǎng)基內(nèi)。

（3）含L-阿拉伯糖的NGM培養(yǎng)基：配制L-阿拉伯糖濃度分別為5、10、15、20、40 mmol/L，然后按1：1與線蟲混合，再涂布到含葡萄糖的NGM培養(yǎng)基，得到L-阿拉伯糖的終濃度分別是2.5、5、7.5、10、20 mmol/L。

1.4.2 線蟲的培養(yǎng)與同步化

在超凈工作臺上，將1 mL的大腸桿菌OP50涂布到配制好的NMG培養(yǎng)基上，然后自然干燥，放于4 ℃的冰箱內(nèi)備用。將秀麗隱桿線蟲接種于上述含有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為20 ℃，培養(yǎng)到產(chǎn)卵期。用2 mL M9緩沖液將大量處于產(chǎn)卵期的雌雄同體秀麗隱桿線蟲成蟲從NGM固體培養(yǎng)基表面沖洗下來并轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，然后3000 r/min離心1.5 min，棄上清。向EP管中加入1 mL裂解液，上下顛倒混勻裂解5 min，3000 r/min離心1.5 min，棄上清，然后用無菌M9緩沖液反復清洗3次，充分去除裂解液成分，得到同步化后的蟲卵[7]。

1.4.3 暴露方法

將同步化后的蟲卵置于含有不同濃度的 L-阿拉伯糖并涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基，和含有葡萄糖并涂有大腸桿菌 OP50的 NGM 培養(yǎng)基中，20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，此時秀麗隱桿線蟲處于L4期，再養(yǎng)12 h可測定各項指標，同時進行三次平行試驗。

1.4.4 生長發(fā)育指標的測定[8]

（1）頭部擺動頻率：將秀麗隱桿線蟲置于含有60 μL M9緩沖液的載玻片上，等待其經(jīng)過1 min的適應，行為恢復穩(wěn)定后，在體視顯微鏡下觀察并記錄秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率。每個濃度測量20條秀麗隱桿線蟲。頭部擺動頻率的標準為1 min內(nèi)頭部從一側(cè)擺到另一側(cè)再擺回來的次數(shù)。

（2）身體彎曲頻率：將線蟲置于表面未涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上，等待線蟲恢復1 min以去除身體粘附的大腸桿菌，然后在體視顯微鏡下觀察并記錄秀麗隱桿線蟲1 min內(nèi)的身體彎曲頻率。每個濃度測量20條秀麗隱桿線蟲。一次身體彎曲的標準為假定沿著咽泵的方向是y軸，線蟲爬行過程中身體沿著相應x軸方向上的一次改變。

（3）身體長度的測定：將線蟲轉(zhuǎn)移到載玻片上，經(jīng)麻醉劑麻醉，置于顯微鏡下觀察并測量身長。

（4）子代數(shù)目：在涂有大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上挑1只待測的線蟲，放置在20 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在產(chǎn)卵期內(nèi)每天將線蟲轉(zhuǎn)移到新的NGM培養(yǎng)基內(nèi)，含有蟲卵的舊平板繼續(xù)放置在 20 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，然后對每個平板內(nèi)的線蟲的數(shù)目進行統(tǒng)計、相加。等到線蟲的排卵期結束后，計算每條線蟲總的子代數(shù)目。

1.4.5 甘油三酯含量的測定

用M9緩沖液將線蟲沖洗三遍，離心棄上清，加入150 μL M9緩沖液超聲破碎蟲體提取甘油三酯，超聲條件：超聲功率為100 W，工作時間為20 s，暫停時間為60 s，重復8個循環(huán)；或者采用勻漿器進行研磨：加入M9緩沖液使得總體積為300 μL，進行研磨，最后在倒置顯微鏡下取20 μL蟲液觀察線蟲是否都已經(jīng)破碎（研磨過程需冰浴）。線蟲研磨充分后，將各濃度組研磨管置于 4 ℃離心機中 5000 r/min離心 10 min，將離心后上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。根據(jù)試劑盒說明測定甘油三酯含量。

1.4.6 油紅O染色

油紅O染色方法參照Ramirez等的染色方法[9]，每個濃度組取生長至L4末期的線蟲，用M9緩沖液將平板中的線蟲洗脫于離心管中，轉(zhuǎn)速為1500 r/min離心2 min去上清，重復洗脫三次；加入體積分數(shù)為60%的異丙醇，使線蟲脫水，15 min后洗去異丙醇溶液；加入油紅O染色30 min，用M9反復沖洗6次；將線蟲轉(zhuǎn)移到NGM平板上，隨機挑取20只線蟲置于載玻片上，顯微鏡下觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 12.0進行顯著性分析，顯著水平設定為*p＜0.05、**p＜0.01。

2 結果與討論

2.1 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲生長指標的影響

2.1.1 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率的影響

頭部擺動頻率是線蟲運動能力的一項重要指標，將葡萄糖作為對照組，設置L-阿拉伯糖的濃度分別為2.5、5、7.5、10、20 mmol/L，研究不同濃度下秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率變化。結果如圖1顯示，當L-阿拉伯糖濃度為5 mmol/L時，線蟲頭部擺動頻率出現(xiàn)顯著性增加（p＜0.05），與對照組相比增加了16.43%；當濃度在 7.5～20 mmol/L時，出現(xiàn)極顯著性增長（p＜0.01）；與對照組相比，20 mmol/L組的頭部擺動頻率增加了19.72%；試驗結果表明，L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率有顯著性促進作用。

圖1 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲頭部擺動頻率的影響Fig.1 Effect of L-arabinose on the head swing frequency of Caenorhabditis elegans

2.1.2 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲身體彎曲頻率的影響

線蟲身體彎曲頻率的大小表明其運動能力的強弱。如圖2所示，當L-阿拉伯糖濃度為2.5 mmol/L和10 mmol/L時，線蟲身體彎曲頻率稍有增長，相對于對照組分別增加了 7.32%、9.02%；隨著 L-阿拉伯糖濃度的增加，線蟲身體彎曲的頻率保持相對穩(wěn)定的水平狀態(tài)。但統(tǒng)計分析結果表明，與葡萄糖對照組相比，L-阿拉伯糖對線蟲身體彎曲頻率的影響效果不顯著（p＜0.05，p＜0.01）。

圖2 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲身體彎曲頻率的影響Fig.2 Effect of L-arabinose on body bending frequency of Caenorhabditis elegans

2.1.3 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲子代數(shù)目的影響

不同濃度 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲子代數(shù)目的影響結果如圖 3所示，當 L-阿拉伯糖濃度為 2.5 mmol/L時，子代數(shù)目最多，相對于對照組增加了1.43%；但隨著 L-阿拉伯糖濃度的增加，秀麗隱桿線蟲的子代數(shù)目沒有顯著性的增加或減少（p＜0.05，p＜0.01），維持在一個較為穩(wěn)定的水平，表明在現(xiàn)有濃度作用下，L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲子代數(shù)目無顯著影響。

圖3 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲子代數(shù)目的影響Fig.3 Effect of L-arabinose on the brood size of Caenorhabditis elegans

2.1.4 L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲身體長度的影響

如圖4結果顯示，與對照組相比，當L-阿拉伯糖濃度為2.5 mmol/L，線蟲身體長度開始出現(xiàn)增長的狀態(tài)，說明此時阿拉伯糖的濃度有促進線蟲身體生長作用；當濃度達到7.5 mmol/L時，線蟲身體長度增長明顯（p＜0.05），與對照組相比增加了 10.89%；當濃度大于7.5 mmol/L，與5 mmol/L濃度下的線蟲身體長度相比無明顯變化，維持在較為穩(wěn)定的水平。

圖4 L-阿拉伯糖濃度對秀麗隱桿線蟲身體長度的影響Fig.4 Effect of L-arabinose on body length of Caenorhabditis elegans

2.2 甘油三酯含量的測定

甘油三酯是脂肪合成的重要原料，如果甘油三酯含量降低，將會導致脂肪合成的減少，從而達到降脂的效果。圖5結果顯示，在2.5～20 mmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著L-阿拉伯糖濃度的逐漸增加，與葡萄糖對照組相比，L-阿拉伯糖試驗組中秀麗線蟲體內(nèi)的甘油三酯含量下降均極為顯著（p＜0.01）；當L-阿拉伯糖濃度為2.5 mmol/L，相比于對照組其甘油三酯含量降低了45.56%；而當L-阿拉伯糖濃度為20 mmol/L時，線蟲體內(nèi)的甘油三酯含量與對照組相比降低了67.34%，說明L-阿拉伯糖具有良好的降低線蟲脂肪合成的能力。

圖5 L-阿拉伯糖對甘油三酯含量的影響Fig.5 Effect of L-arabinose on triglyceride contents

2.3 油紅O染色

試驗通過油紅O染色檢測分析了線蟲體內(nèi)脂肪的變化情況。圖6結果可以直觀的顯示，試驗組線蟲的脂肪含量明顯要低于對照組，且隨著L-阿拉伯糖濃度的不斷增加脂肪含量逐漸減少。這一試驗結果和甘油三酯含量測定結果相同，進一步說明L-阿拉伯糖具有明顯的降低脂肪合成作用，具有一定的降脂功效。

圖6 油紅O染色結果Fig.6 The results of oil red O staining

3 結論

隨著 L-阿拉伯糖功能性質(zhì)研究的深入以及生產(chǎn)成本的逐漸降低，其在食品、保健、醫(yī)藥等領域具有廣闊的應用前景。本文通過研究不同濃度L-阿拉伯糖對秀麗隱桿線蟲生長發(fā)育的影響，結果表明L-阿拉伯糖能夠一定程度上促進秀麗隱桿線蟲的頭部擺動頻率和身體的生長；已有研究報道指出，經(jīng)L-阿拉伯糖作用后大鼠體重、空腹血糖、甘油三酯含量均有明顯下降[10]，L-阿拉伯糖對人體腸道血糖酶活性也有降低作用[11]。本研究通過線蟲體內(nèi)甘油三酯含量的測定和油紅O染色試驗，表明L-阿拉伯糖可能通過調(diào)控糖脂代謝相關基因從而降低線蟲體內(nèi)甘油三酯含量，導致了脂肪合成量的減少；李凱[12]研究報道了L-阿拉伯糖可通過上調(diào)控肝臟CPT-Iα、PDK4 mRNA的表達，下調(diào)ACCαmRNA的表達，使大鼠糖脂代謝改善、體重增加有延緩趨勢?；谝陨显囼灱捌溲芯拷Y果，可進一步通過分子生物學等手段，以秀麗隱桿線蟲作為研究對象，繼續(xù)探索并解析L-阿拉伯糖對生物體糖脂代謝等方面的調(diào)節(jié)機制，有助于明確L-阿拉伯糖這一重要代糖資源的生理功能及其健康促進功效。