鄧 思，王海琪，白曼利，楊遠(yuǎn)帆,2,3,4，黃高凌,2,3,4，杜希萍,2,3,4，倪 輝,2,3,4

(1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021； 3.廈門(mén)市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361021； 4.廈門(mén)南方海洋研究中心海藻資源化利用與深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361021)

0 引言

法夫酵母(Phaffiarhodozyma)是一種能利用多種碳源和氮源進(jìn)行異養(yǎng)代謝合成各種類(lèi)胡蘿卜素的紅色酵母，其中的類(lèi)胡蘿卜素包含蝦青素[1-3]、β-胡蘿卜素[4-5]、海膽酮、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、番茄紅素[6]及斑蝥黃等[7]。由于法夫酵母代謝合成類(lèi)胡蘿卜素時(shí)不受氣候和地域等因素的影響，因而它具有生長(zhǎng)快、高密度培養(yǎng)容易、蝦青素積累迅速且活性強(qiáng)等特點(diǎn)，是一類(lèi)極具產(chǎn)業(yè)化發(fā)展前景的天然蝦青素資源。

肝損傷是一種急性肝臟功能異常的疾病[8]，它是由肝缺血再灌注、有毒物質(zhì)、肝毒性藥物以及病毒感染等因素導(dǎo)致的。一般情況下，造成機(jī)體肝硬化、肝癌的主要因素是肝纖維化的產(chǎn)生[9]，而肝纖維化一般是由持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的肝損傷誘發(fā)的[10-11]。一般在臨床上，防止和預(yù)防肝損傷是肝病治療不可或缺的防御環(huán)節(jié)，早期及時(shí)發(fā)現(xiàn)和對(duì)癥治療均對(duì)預(yù)防肝病意義重大[12]。

肝損傷一般分為化學(xué)性肝損傷和病理性肝損傷兩類(lèi)[13]，其中臨床上最為常見(jiàn)的是化學(xué)性肝損傷。而實(shí)驗(yàn)中常用CCl4、酒精等使肝臟中毒，形成化學(xué)性肝損傷的模型[14-15]。CCl4對(duì)肝臟的毒性存在多種作用機(jī)制，其中導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生過(guò)量自由基被認(rèn)為是肝損傷發(fā)生的主導(dǎo)因素[16]。過(guò)量的自由基不僅攻擊肝細(xì)胞膜上的磷脂分子，損傷細(xì)胞膜的完整性，而且可引起肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，誘發(fā)細(xì)胞死亡。同時(shí)，自由基也可與肝細(xì)胞內(nèi)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，攻擊膜不飽和脂質(zhì)，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性被破壞以及通透程度加大，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)等從細(xì)胞質(zhì)中大量溢出進(jìn)入血液中。因此，評(píng)價(jià)肝損傷的指標(biāo)可轉(zhuǎn)化為測(cè)定血清中ALT和AST的活性。相關(guān)研究表明[17-18]，多種廣泛使用且效果穩(wěn)定的藥物如維生素E、褪黑素、乙酰半胱氨酸等都可以通過(guò)清除自由基或者抑制自由基的產(chǎn)生起到減弱肝損傷的功能。

如今，隨著化學(xué)性肝損傷病人的增加，研發(fā)對(duì)化學(xué)性肝損傷具有保護(hù)作用的保健食品已成為研究熱點(diǎn)之一。而類(lèi)胡蘿卜素不僅具有較強(qiáng)的清除自由基和淬滅活性氧的能力[19]，而且能有效防止脂質(zhì)過(guò)氧化[20-21]。因此，本文采用溶劑浸提法提取法夫酵母類(lèi)胡蘿卜素，通過(guò)建立CCl4誘導(dǎo)大鼠化學(xué)性肝損傷模型，檢測(cè)大鼠血清中ALT、AST活性，并觀察肝臟細(xì)胞的病理?yè)p傷情況，研究其對(duì)化學(xué)性肝損傷的作用，為保護(hù)化學(xué)性肝損傷的天然保健食品的研發(fā)提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從廣東省購(gòu)買(mǎi)60只SPF級(jí)的雄性SD大鼠(批準(zhǔn)號(hào)SCXK(粵)2013-0002)，且這60只大鼠的體質(zhì)量均在160～180 g。將60只大鼠進(jìn)行4 d的檢疫，選定健康的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每天定期檢查大鼠1次，除去不健康的大鼠，如此往復(fù)，將檢疫后最終健康的大鼠進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，使用飽和苦味酸對(duì)60只大鼠進(jìn)行編號(hào)，其中大鼠的不同部位也同樣需要染色編號(hào)處理，這兩種處理就組成了60只大鼠的雙重識(shí)別標(biāo)記。采用一箱5只大鼠的分配方式將60只大鼠進(jìn)行分組群養(yǎng)，對(duì)所有的大鼠均使用晝夜時(shí)間比為10 h∶14 h的方式進(jìn)行間斷照明處理。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，按照要求對(duì)60只大鼠均喂以相應(yīng)的顆粒飼料，允許它們?cè)陲曫B(yǎng)期間自由進(jìn)食飲水。為了確保最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，在飼養(yǎng)過(guò)程中，保證了環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。

1.1.2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品 (100%，United States Pharmacopeia Reference Standard (USP))購(gòu)置于美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 主要試劑

玉米油購(gòu)于益海糧油工業(yè)有限公司；聯(lián)苯雙酯滴丸試劑購(gòu)于廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司；CCl4購(gòu)于廣州市中南化學(xué)試劑有限公司；橄欖油購(gòu)于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；烏拉坦購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ALT和AST試劑盒均購(gòu)于上?？迫A生物工程股份有限公司，批號(hào)分別為20151222和20151122。

1.2 主要儀器與設(shè)備

BS-3000A電子天平，上海友聲衡器有限公司；CS-VI型攤片烤片機(jī)，湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司；RM2235型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、ASP300S型全自動(dòng)脫水機(jī)、EG1150型生物組織包埋機(jī)、AutoStainer-XL型自動(dòng)染色機(jī)均為德國(guó)LEICA?。

1.3 方法

1.3.1 類(lèi)胡蘿卜素提取物的制備

稱(chēng)取10 g法夫酵母菌體(廈門(mén)匯盛生物有限公司提供)于500 mL離心杯中，向離心杯中加入6 mol/L的乳酸溶液200 mL，用玻璃棒將其攪拌均勻，于30 ℃的水浴條件下進(jìn)行破壁處理10 min。恒溫水浴結(jié)束后，4 500 r/min離心10 min。離心后除掉上層粘稠的乳酸溶液，將200 mL蒸餾水加入離心杯中，用玻璃棒攪拌均勻。將加入蒸餾水的菌體液再次4 500 r/min進(jìn)行離心10 min。離心后除掉上層液體，用蒸餾水反復(fù)進(jìn)行以上操作3次。將200 mL丙酮加入離心杯底剩余的菌體中，用玻璃棒攪拌均勻，在常溫下浸提5 min。浸提結(jié)束后，4 500 r/min離心10 min。收集離心后的上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮上清液，對(duì)浸提液丙酮進(jìn)行回收，最終得到的類(lèi)胡蘿卜素浸膏即為試驗(yàn)的受試物。

1.3.2 類(lèi)胡蘿卜素提取物成分的分析

表1 ZORBAX SB-C18色譜柱的梯度洗脫條件Tab.1 The gradient elution conditions of ZORBAX SB-C18 columns時(shí)間Time/minφ(超純水Ultra-pure water)/%(A泵)φ(甲醇Methanol)/%(B泵)01585400100580100661585

采用高壓液相色譜法(high perfor- mance liquid chromatography,HPLC)對(duì)類(lèi)胡蘿卜素提取物中的成分進(jìn)行分析。由超純水(A泵)及甲醇(B泵)組成高效液相色譜的溶劑系統(tǒng)，用ZORBAX SB-C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，3.5 μm)對(duì)樣品進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件如表1所示。檢測(cè)波長(zhǎng)為474 nm，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為35 ℃，流速為0.2 mL/min。

1.3.3 大鼠分組和處理

將實(shí)驗(yàn)室檢疫合格后的大鼠按照質(zhì)量隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為正常組，模型組，聯(lián)苯雙酯組，低、中、高劑量組。用玉米油將受試物稀釋至75.0,37.50,18.75 g/L 后分別用于高、中、低3個(gè)劑量組對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃處理，以上實(shí)驗(yàn)的灌胃劑量分別相當(dāng)于人體臨床用量的10倍、5倍、2.5倍(受試樣品的急性經(jīng)口毒性為L(zhǎng)D50>15 g/kg，人體臨床用量約為0.075 g·kg-1·d-1)。正常組和模型組大鼠每日經(jīng)口灌胃相同量的玉米油，聯(lián)苯雙酯組則每日經(jīng)口灌胃劑量質(zhì)量濃度為15 g/L的聯(lián)苯雙酯滴丸。調(diào)節(jié)藥物濃度，采用10 mL/kg給大鼠進(jìn)行30 d連續(xù)灌胃給藥處理，1次/d。在對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃處理的30 d內(nèi)，每天都需要對(duì)大鼠的狀態(tài)進(jìn)行相應(yīng)的觀察，并詳細(xì)記錄。在30 d灌胃試驗(yàn)開(kāi)始以及結(jié)束時(shí)，均需要對(duì)大鼠的質(zhì)量進(jìn)行1次測(cè)量。在灌胃試驗(yàn)期間，每周都需要對(duì)大鼠的質(zhì)量進(jìn)行2次測(cè)量，并詳細(xì)記錄[22-24]。

1.3.4 大鼠肝損傷的CCl4模型構(gòu)建

在試驗(yàn)第30 d將各試驗(yàn)組大鼠隔夜禁食不禁水約16 h后，正常組給予橄欖油，其余各試驗(yàn)組的大鼠則從腹腔處注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%CCl4橄欖油溶液(按10 mL/kg)[25]。將相對(duì)應(yīng)劑量的受試樣品于4 h后灌胃給不同劑量組的大鼠，而將同等量的玉米油灌胃給正常組和模型組的大鼠，最后按照10 mL/kg的量對(duì)聯(lián)苯雙酯組的大鼠進(jìn)行聯(lián)苯雙酯滴丸的灌胃。

1.3.5 血清生化指標(biāo)測(cè)定

注射CCl4處理大鼠24 h后，測(cè)定大鼠血清中AST和ALT的活力水平。

1.3.6 肝臟組織病理檢查

解剖大鼠取其肝臟，將肝臟固定后進(jìn)行病理組織學(xué)的檢查。在普通光學(xué)顯微鏡下對(duì)大鼠的肝結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察并詳細(xì)記錄，根據(jù)病變程度對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)的評(píng)分[26]，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

2 結(jié)果與分析

2.1 類(lèi)胡蘿卜素提取物成分的分析

采用HPLC分析方法，對(duì)類(lèi)胡蘿卜素提取物成分與已有的類(lèi)胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品(海膽酮、β-胡蘿卜素等)進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1和圖2所示。將圖1與圖2進(jìn)行對(duì)比分析可知，類(lèi)胡蘿卜素提取物的主要成分為蝦青素，且蝦青素在類(lèi)胡蘿卜素提取物中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)70.24%。而沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與保留時(shí)間分別為18.570，23.147，39.091 min相近的類(lèi)胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品(海膽酮保留時(shí)間45.926 min，β-胡蘿卜素保留時(shí)間60.213 min等)。

2.2 類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)大鼠質(zhì)量的影響

在30 d試驗(yàn)期間，每組大鼠的生理狀態(tài)均正常，類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)每組大鼠質(zhì)量的影響情況如表3所示。由表3可知：模型組與正常組比較，兩組中的大鼠在測(cè)定期間質(zhì)量均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05；低、中、高3個(gè)劑量組的大鼠分別與模型組比較，除了中劑量組的大鼠在第8 d和第15 d時(shí)質(zhì)量有所減輕(P<0.05)之外，其余各組大鼠的質(zhì)量在測(cè)定時(shí)期均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

說(shuō)明：*表示與模型組之間的比較，且“*”表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05

Notes：* indicated the comparison with the model group,and indicated statistical difference,P<0.05

2.3 類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)大鼠血清ALT、AST活力的影響

類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)試驗(yàn)中各組大鼠血清指標(biāo)影響結(jié)果如表4所示。由表4可以看出：與正常組相比，模型組大鼠血清中的ALT、AST顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05，表明CCl4對(duì)肝臟有明顯損傷作用。與模型組比較，低、中兩個(gè)劑量組的大鼠血清中ALT、AST的活力均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05，但聯(lián)苯雙酯組和高劑量組中大鼠血清ALT活力有所降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05，表明聯(lián)苯雙酯滴丸與高劑量法夫酵母類(lèi)胡蘿卜素提取物均對(duì)大鼠的肝臟組織有一定程度的保護(hù)作用。

表4 類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)大鼠血清ALT、AST活力的影響

說(shuō)明：#表示與正常組之間的比較， 其中“#”表示P<0.05，而“##”表示P<0.01。*表示與模型組之間的比較，其中“*” 表示P<0.05，而“**”表示P<0.01

Notes：# indicated a comparison with the normal group,indicatingP<0.05,while ## indicatingP<0.01.* indicated a comparison with the model group,indicatingP<0.05,while ** indicatingP<0.01

2.4 類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)大鼠肝臟組織病理學(xué)的影響

對(duì)大鼠肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，其結(jié)果如圖3所示。正常組大鼠的肝臟組織良好，無(wú)異常變化(見(jiàn)圖3a)。模型組和低劑量組大鼠的肝臟組織損傷最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為：在中央靜脈附近出現(xiàn)了脂肪變性的現(xiàn)象，有小空泡，呈圓形，部分肝細(xì)胞壞死甚至崩解，產(chǎn)生炎性細(xì)胞的聚集；在脂肪變性病灶的外緣，大量肝細(xì)胞發(fā)生氣球樣變，細(xì)胞腫大，細(xì)胞核濃縮甚至消失，胞質(zhì)空化，如圖3b和圖3d所示。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組和高劑量組僅僅出現(xiàn)少數(shù)肝細(xì)胞壞死或崩解，氣球樣變(見(jiàn)圖3c和圖3f)。中劑量組則發(fā)生部分肝細(xì)胞壞死或崩解，氣球樣變(圖3e)。以上結(jié)果表明，聯(lián)苯雙酯滴丸和不同劑量的類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)大鼠的肝臟具有一定程度的保護(hù)作用，其中高劑量的法夫酵母類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)大鼠的肝臟保護(hù)作用最為顯著。

試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠肝臟組織進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分，其結(jié)果如表5所示。由表5可知，模型組與正常組比較，模型組大鼠的肝臟細(xì)胞損傷嚴(yán)重，差異顯著(P<0.05)，主要表現(xiàn)為氣球樣變、脂肪變性、肝細(xì)胞壞死等現(xiàn)象。

表5 類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)大鼠肝臟組織病理學(xué)的評(píng)分結(jié)果

說(shuō)明：?jiǎn)我蛩胤讲罘治龅闹笜?biāo)為脂肪變性和肝細(xì)胞壞死，進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換的單因素方差分析的指標(biāo)為水樣變性，秩和檢驗(yàn)的指標(biāo)為氣球樣變。#表示與正常組之間的比較，其中“#”表示P<0.05，而*則表示與模型組之間的比較，其中“*”表示P<0.05

Notes：The index of single factor ANOVA were steatosis and hepatocyte necrosis.The index of variable conversion of single factor ANOVA was water sample,and the index of rank-sum test was balloon-like.# indicated a comparison with the normal group,indicatingP<0.05,while * indicated a comparison with the model group,indicatingP<0.05

聯(lián)苯雙酯組與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組中只有肝細(xì)胞壞死這一個(gè)指標(biāo)差異顯著，其余病變指標(biāo)均沒(méi)有顯著性差異；低劑量組與模型組比較，低劑量組中也只有肝細(xì)胞脂肪變性這一個(gè)指標(biāo)差異顯著，其余病變指標(biāo)均沒(méi)有顯著性差異；中、高兩個(gè)劑量組分別與模型組比較，這兩組大鼠的肝細(xì)胞壞死程度在加入受試樣品后顯著減輕，并且高劑量組大鼠的肝細(xì)胞脂肪變性也顯著減輕。綜上所述，與模型組相比，聯(lián)苯雙酯滴丸和不同劑量類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)減輕肝細(xì)胞損傷均有不同程度的作用，表明法夫酵母類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)大鼠化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)作用。

據(jù)報(bào)道，CCl4可通過(guò)影響細(xì)胞色素P450，進(jìn)而代謝產(chǎn)生活潑的自由基及一系列氧活性物并最終導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡、肝組織生理生化指標(biāo)發(fā)生異常變化[27]。蝦青素不僅具有增強(qiáng)免疫力以及抗炎[28]等生物活性，而且具有很強(qiáng)的抗氧化[29]、清除自由基[30]的能力。推測(cè)法夫酵母類(lèi)胡蘿卜素提取物保護(hù)大鼠肝臟的原因可能為：通過(guò)蝦青素等類(lèi)胡蘿卜素清除自由基，從而減少自由基對(duì)肝細(xì)胞膜上的磷脂分子的攻擊，保護(hù)了細(xì)胞膜的完整性[31-32]。同時(shí)通過(guò)清除自由基，減少自由基與肝細(xì)胞內(nèi)大分子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，減輕膜不飽和脂質(zhì)的攻擊，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和通透性[33]，進(jìn)而阻止了ALT、AST從細(xì)胞質(zhì)中大量溢出。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組的ALT、AST均高于正常組，肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變、肝細(xì)胞壞死程度高于正常組，說(shuō)明CCl4肝損傷模型造模成功。3種不同劑量的法夫酵母類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)肝病變都有不同程度的減輕，同時(shí)高劑量組大鼠血清ALT與模型組比較顯著降低(P<0.05)，表明法夫酵母類(lèi)胡蘿卜素提取物對(duì)大鼠肝臟有一定程度的保護(hù)作用。對(duì)法夫酵母類(lèi)胡蘿卜素提取物進(jìn)行成分分析發(fā)現(xiàn)，其主要成分為蝦青素。