何丹

遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 營(yíng)口 115009

引言

人參皂苷是藥材人參的最重要的活性成分之一，口服人參后，大多數(shù)多糖基的人參二醇類皂苷（PPD）不能被人體直接吸收，通常會(huì)在人體消化系統(tǒng)中的酶和腸道菌的作用下，水解掉苷元上連接的糖基生成活性更高的低糖基皂苷，例如F2和C-K等天然人參中含量極低的稀有皂苷[1]。如果在體外完成這種轉(zhuǎn)化，會(huì)提高人體的利用率。因此，在體外制備人參皂苷F2對(duì)人參乃至醫(yī)藥行業(yè)具有重要意義。

生物轉(zhuǎn)化法是一種極具潛力的方法，用此法制備低糖基的皂苷具有環(huán)境友好、副產(chǎn)物少、后處理簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室在此方面做了大量的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了能轉(zhuǎn)化多糖基二醇類人參皂苷的微生物，還有人參皂苷酶I型、II、型、III型、IV型[2-5]，其中的Ⅰ型人參皂苷酶可以水解PPD生成人參皂苷F2。本文利用Ⅰ型人參皂苷酶轉(zhuǎn)化PPD生成的人參皂苷F2進(jìn)行分離純化，并利用核磁共振法鑒定其結(jié)構(gòu)。

本文對(duì)用槐花誘導(dǎo)的sp.848菌產(chǎn)的人參皂苷Ⅰ型酶轉(zhuǎn)化人參二醇類皂苷PPD制備的粗品人參皂苷C-K進(jìn)行了分離純化，經(jīng)高效液相色譜分析產(chǎn)品純度，并用核磁共振法確定了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品F2、C-K，PPD酶反應(yīng)產(chǎn)物（主要含F(xiàn)2），本實(shí)驗(yàn)室提供；薄層層析板Silica gel 60-F254，德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；AB-8樹(shù)脂、D-296樹(shù)脂，南開(kāi)大學(xué)化工廠生產(chǎn)；柱層層析硅膠，青島海洋化工廠分廠產(chǎn)品；高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 人參皂苷F2的分離純化

取50g脫糖脫色后的、來(lái)源于酶轉(zhuǎn)化PPD的人參皂苷F2粗產(chǎn)品，與125倍體積的80-100目硅膠混合，制成樣品膠，用900g的300-400目的硅膠作為分離膠進(jìn)行分離。用V（氯仿）：V（甲醇）= 9∶1的洗脫液洗脫，將相同的組分收集合并，干燥、稱重。取純度最高的F2產(chǎn)品進(jìn)行高效液相色譜及核磁共振檢測(cè)。

1.2.2 薄層層析法

用薄層層析法對(duì)皂苷進(jìn)行檢測(cè)，展開(kāi)劑為V(氯仿)：V(甲醇)：V(水)=7∶2.5∶0.5，顯色劑為10%的硫酸溶液，加熱顯色。將樣品點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)對(duì)照以確定樣品中所含皂苷成分[6]。

1.2.3 高效液相色譜檢測(cè)產(chǎn)品純度

經(jīng)硅膠分離得到的產(chǎn)品采用高效液相色譜法分析，美國(guó)Waters 2695型高效液相色譜儀、Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器、Empower2色譜工作站；色譜柱為Knauer (5 μm,250 mm×3 mm）；流動(dòng)相為乙腈（A）和水（B）；進(jìn)樣量，10 μL；柱溫，35℃；流速，0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)，203 nm。流動(dòng)相比例見(jiàn)表1：

表1 流動(dòng)相比例表Table 1 Rate of mobile phase

1.2.4 核磁共振法分析產(chǎn)品結(jié)構(gòu)

采用核磁共振法檢測(cè)人參皂苷F2的結(jié)構(gòu)，測(cè)試儀器為瑞士Bruke AVANCE 600 超導(dǎo)核磁共振波譜儀，檢測(cè)條件為探頭5 mm BBO，溶劑為Pyridine-D5 (氘代吡啶)。

2.結(jié)果與討論

2.1 硅膠柱層析法分離人參皂苷F2

本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)利用豆粕誘導(dǎo)的sp.848菌產(chǎn)的人參皂苷Ⅰ型酶轉(zhuǎn)化人參二醇類皂苷PPD制備了粗品人參皂苷F2。取經(jīng)過(guò)脫糖脫色處理后的F2粗品50g，進(jìn)行硅膠柱層析分離，得到高純度的F2 共4.19g，得率8.38%。TLC檢測(cè)結(jié)果如圖1所示：

圖1 硅膠分離的F2的TLC檢測(cè)圖Figure 1 TLC of ginsenoside F2 after separation by silica gel

從圖1可以看看出，樣品與F2標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率相同，說(shuō)明為同一種物質(zhì)。然后采用HPLC檢測(cè)樣品，結(jié)果如圖2所示。

圖2 硅膠分離的F2的HPLC圖譜Figure 2 HPLC of ginsenoside F2 after separation by silica gel

由圖可知，分離得到的F2產(chǎn)品的純度約為96.7%。

2.2 人參皂苷F2的結(jié)構(gòu)分析

采用核磁共振法對(duì)經(jīng)硅膠柱分離得到的純品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。其一維13C核磁共振譜（13C NMR）如圖3所示：

圖3 樣品F2的一維13C NNE核磁共振譜全圖Fig. 3 13C NNE NMR full Score of F2

根據(jù)一維13C核磁共振譜圖分析：從一維13C NMR定量譜中可以觀察到42條譜線，譜線無(wú)重疊。積分面積為原子個(gè)數(shù)相對(duì)比，故由相對(duì)積分面積可知，該樣品中含有42個(gè)碳原子。烯碳區(qū)（δ 120～130 ppm）的兩條譜線是由2個(gè)烯碳所貢獻(xiàn)的，說(shuō)明化合物中含有－CH＝C＜獨(dú)立雙鍵結(jié)構(gòu)。氧碳區(qū)（δ 60～110 ppm）共有15條譜線，是由人參皂苷中與氧相連的碳所貢獻(xiàn)的，此區(qū)應(yīng)該有1個(gè)季碳，2個(gè)－CH2－質(zhì)子碳和12個(gè)＞CH－質(zhì)子碳。其中，最低場(chǎng)的δ 107.10 ppm位移峰應(yīng)歸屬于3-O-Glc上的第1’號(hào)碳，δ 98.42 ppm位移峰歸應(yīng)屬于20-O-Glc上的第1’號(hào)碳，這兩個(gè)位移峰由于受到糖苷鍵的影響而落到此處。位于氧碳區(qū)最高場(chǎng)的δ 63.04 ppm、δ 63.24 ppm位移峰應(yīng)分別歸屬于20-O-Glc上的第6’號(hào)碳和3-O-Glc上的第6’號(hào)碳所貢獻(xiàn)。氧碳區(qū)最低場(chǎng)的δ 107.10 ppm、δ 98.42 ppm位移峰應(yīng)分別歸屬于3-O-Glc上的第1’號(hào)碳和20-O-Glc上的第1’號(hào)碳所貢獻(xiàn)。人參皂苷元為飽和四環(huán)式結(jié)構(gòu)，化學(xué)位移值相差很小，甲基位移十分相近。通過(guò)對(duì)比13C NMR譜該區(qū)域（δ 0～110 ppm）各位移峰的化學(xué)位移和文獻(xiàn)[7]中的數(shù)據(jù)，確定了樣品F2結(jié)構(gòu)中1～30號(hào)碳的化學(xué)位移。如表3所示。從表3中可以看出，第22號(hào)碳化學(xué)位移落在δ 36.31 ppm、第21號(hào)碳化學(xué)位移落在δ 25.95 ppm，說(shuō)明該化合物為20(S)構(gòu)型。

圖3 樣品F2的一維13C NNE核磁共振譜全圖Fig. 3 13C NNE NMR full Score of F2

綜上所述，樣品為人參皂苷C-K（3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參二醇），結(jié)構(gòu)式如圖4所示，分子式為C42H72O13，分子量為785.01。

圖4 人參皂苷F2結(jié)構(gòu)Figure 4 Structure of ginsenoside F2

3 . 結(jié)論

本文采用硅膠柱層析法，對(duì)前期采用生物酶轉(zhuǎn)化法制備、并經(jīng)脫糖脫色處理過(guò)的粗品人參皂苷F2進(jìn)行了分離純化，并采用核磁共振法測(cè)定了其結(jié)構(gòu)。50g的F2粗品經(jīng)硅膠層析分離后，得到純度為96.7%的F2共4.19g，得率為8.38%。采用核磁共振（NMR）法對(duì)分離后的產(chǎn)品進(jìn)行分析鑒定，最終確定了其結(jié)構(gòu)，即3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人參二醇，分子式為C42H72O13，分子量為785.01。