楊 湛，陳 艾，胡良才

(1.重慶市九龍坡區(qū)婦幼保健院，重慶 400050；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，四川 瀘州 646000；3.重慶市江北區(qū)中醫(yī)院，重慶 400020)

新生兒缺氧缺血性腦病(neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是指圍產(chǎn)期窒息后腦部缺氧引起的缺血性損害。調(diào)查研究顯示，0.2%～0.4%的足月新生兒出生時(shí)或生后不久出現(xiàn)窒息，約15%～20%的HIE患兒死亡。因HIE發(fā)病因素較多，且存活者中25%存在永久性的神經(jīng)心理缺陷，如智力低下、腦癱、癲癇等，給患兒家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。所以HIE一直受到整個(gè)社會和醫(yī)學(xué)界的高度重視。HIE損傷及修復(fù)過程十分復(fù)雜，涉及到血腦屏障、血管形成、神經(jīng)元自噬凋亡及各種信號通路，蛋白調(diào)控等機(jī)制。隨著醫(yī)學(xué)生物信息學(xué)分析技術(shù)的飛速發(fā)展，學(xué)者們對HIE的研究更多涉及基因組(gcnomics)水平、轉(zhuǎn)錄組(transcriptomics)水平、蛋白質(zhì)組(proteomics)水平等層次，其中LncRNA的基因表達(dá)調(diào)控作用已成為HIE損傷及修復(fù)機(jī)制研究中的新熱點(diǎn)[1]。

1關(guān)于LncRNA的概述

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度為200nt至100kb、缺乏顯著開放閱讀框(ORF)的非編碼RNA(ncRNA)。據(jù)估計(jì)，人類基因組大約含有7 000～23 000條LncRNA。Clark等(2014年)在對LncRNA的研究中發(fā)現(xiàn)，腦組織中存在一些特有的LncRNA，且在進(jìn)化越高級的哺乳動(dòng)物腦組織中，這些LncRNA的數(shù)量越多越復(fù)雜，提示LncRNA可能在人類腦發(fā)育及高級認(rèn)知功能成長進(jìn)化中起著重要作用。有報(bào)道指出，一些LncRNA參與了神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的許多重要的生理功能，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的反義轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物L(fēng)ncRNA-Bdnf-AS通過與染色質(zhì)結(jié)合，參與其正義轉(zhuǎn)錄的調(diào)控；LncRNA-LOC389023通過影響電壓依賴性鉀離子通道亞單位的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)發(fā)育的調(diào)控；LncRNA-Nkx2.2AS通過促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，參與調(diào)控小腦發(fā)育[2]。

1.1關(guān)于LncRNA的分類

根據(jù)在基因組上相對于蛋白編碼基因的位置，LncRNA可分為五種類型，①正義LncRNA：與蛋白編碼序列的正義鏈重疊；②反義LncRNA：與蛋白編碼序列的反義鏈重疊；③雙向LncRNA：LncRNA序列位于與蛋白轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)相距>1 000bp的反義鏈上，且兩者轉(zhuǎn)錄方向相反；④內(nèi)含子內(nèi)LncRNA：LncRNA序列完全位于另一轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子內(nèi)；⑤基因間LncRNA：LncRNA序列不與任何蛋白編碼基因相鄰近。

1.2關(guān)于LncRNA的作用機(jī)制

有研究指出，LncRNA可調(diào)控各種生物過程的潛在分子機(jī)制，包括染色質(zhì)組織、表觀遺傳調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄翻譯及RNA轉(zhuǎn)換和基因組防御等[3-5]。Hu等[6]根據(jù)相互作用的原理和直接效應(yīng)將LncRNA作用機(jī)制分為以下五種類型，①顯示二級和三級結(jié)構(gòu)，為其他分子提供多個(gè)可結(jié)合位點(diǎn)；②與啟動(dòng)子區(qū)域等基因組DNA元件結(jié)合，并調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄；③與RNA結(jié)合并參與mRNA剪接、編輯、亞細(xì)胞分布和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)；④因具有短開放閱讀框(ORF)編碼肽，LncRNA同mRNA均可發(fā)揮蛋白質(zhì)/肽編碼和非編碼RNA的雙重作用；⑤催化RNA(核酶)，于RNA加工和蛋白質(zhì)合成等在內(nèi)的各種生物過程中起重要作用。

2 LncRNA與HIE的關(guān)系

越來越多的研究顯示，LncRNA在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的生物學(xué)功能，如參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[7]、腦卒中[8]、阿爾茲海默癥[9]、亨廷頓病[10]等，其中部分研究提示某些LncRNA可能參與了缺血性腦病的損傷和修復(fù)過程。例如，有研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-FosDT可通過與REST相關(guān)的染色質(zhì)修飾蛋白相互作用，促進(jìn)缺血性腦損傷，而敲減LncRNA-FosDT則可顯著改善腦缺血后引起的運(yùn)動(dòng)障礙，減少腦梗死體積[11]。

2.1 LncRNA在HIE腦損傷中的作用

目前HIE腦損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，現(xiàn)普遍認(rèn)為腦損傷的發(fā)展可分為以下不同階段：在腦部缺氧缺血發(fā)生后，腦細(xì)胞受損經(jīng)歷第一階段的氧化代謝、興奮性氨基酸的溶脹和細(xì)胞外積聚，以及第二階段的二次能量衰竭期和細(xì)胞瞬時(shí)恢復(fù)(潛伏期)。在隨后的幾小時(shí)至幾天，第二階段的有害機(jī)制繼續(xù)作用導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡。有研究指出這些有害機(jī)制包括興奮性毒性、線粒體功能惡化、炎癥損傷、氧化應(yīng)激、自由基損傷及Ca2+的內(nèi)流等[12-13]。此外，在神經(jīng)細(xì)胞死亡的執(zhí)行階段，細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死在腦損傷的機(jī)制中也顯得至關(guān)重要。在以上各種損傷機(jī)制中，LncRNA與興奮性毒性、炎癥損傷、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡等損傷機(jī)制均有不同程度的關(guān)聯(lián)。

2.1.1 LncRNA與氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激(oxidative stress，OS)是由于氧化與抗氧化機(jī)制失衡，引起細(xì)胞內(nèi)氧自由基的聚積所致。HIE發(fā)生時(shí)，活性氧自由基產(chǎn)生過多，氧化作用高出抗氧化作用，大量的氧自由基堆積，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，引起腦損傷。

Giannakakis等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激后自由基堆積的過程中會出現(xiàn)LncRNA數(shù)量的變動(dòng)。持續(xù)約30分鐘的氧化應(yīng)激反應(yīng)可作用于特定的啟動(dòng)子，能短暫地引起RNA聚合酶Ⅱ停止轉(zhuǎn)錄RNA，導(dǎo)致編碼蛋白的基因數(shù)量下降，引起大量具有啟動(dòng)子相關(guān)性反義LncRNA轉(zhuǎn)錄物(promoter-associated antisense lncRNAs transcripts，si-paancRNAs)產(chǎn)生。雖然這些LncRNA具體調(diào)節(jié)HIE腦損傷氧化應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制尚未明確，但上述LncRNA參與機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，顯示出其調(diào)控HIE腦損傷的可能。

2.1.2 LncRNA與興奮性毒性

興奮性毒性又可稱為谷氨酸受體介導(dǎo)的興奮性神經(jīng)毒性。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元之間的信息傳遞通過突觸來完成，腦缺氧缺血損傷時(shí)，突觸間隙內(nèi)谷氨酸大量堆積，過度激活突觸后的谷氨酸受體，產(chǎn)生興奮性毒性作用，使細(xì)胞腫脹，Ca2+內(nèi)流增加，從而加重腦損傷。新生兒缺氧缺血后腦脊液內(nèi)谷氨酸濃度隨即升高，其增高程度與窒息水平呈正相關(guān)。

REST是位于LncRNA-RMST上游的一種抑制神經(jīng)再生的轉(zhuǎn)錄因子，腦部缺氧缺血后激活REST致使腦內(nèi)介導(dǎo)興奮性突觸傳遞的谷氨酸受體GluR2表達(dá)抑制，引起Ca2+內(nèi)流及神經(jīng)元死亡，進(jìn)而導(dǎo)致腦損傷。Dharap等(2013年)研究表明，REST介導(dǎo)的基因沉默作用可在腦部出現(xiàn)缺氧缺血性損傷后被某些LncRNA(如MRAK154943、XR_005513、MRAK159688)與REST輔抑制物Sin3A及coREST相結(jié)合進(jìn)行調(diào)節(jié)，這些LncRNA可能通過REST介導(dǎo)的基因沉默作用調(diào)節(jié)腦缺氧缺血后引起的興奮性神經(jīng)毒性作用。

2.1.3 LncRNA與炎癥損傷

Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)腦部缺血引發(fā)LncRNA-MALAT1的沉默致使炎性細(xì)胞因子如IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1和e-選擇素的聚集，因此可通過激活LncRNA-MALAT1抑制腦缺血后炎癥反應(yīng)而發(fā)揮血管神經(jīng)保護(hù)作用；Puthanveeti等[17]在對LncRNA-MALAT1的研究中發(fā)現(xiàn)，其可通過激活血清淀粉樣蛋白抗原A3(SAA3)調(diào)節(jié)葡萄糖誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)IL-6和TNF-α的表達(dá)；Krawczyk等(2014年)研究表明LncRNA-PACER可通過阻斷核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)復(fù)合物的形成，影響炎癥因子COX-2基因表達(dá)的啟動(dòng)。雖然目前尚缺乏LncRNA在HIE炎癥反應(yīng)中具體調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，但通過上述LncRNA參與機(jī)體炎癥損傷反應(yīng)的報(bào)道，表明某些LncRNA有調(diào)控腦部缺氧缺血后炎癥損傷的可能。

2.1.4 LncRNA與細(xì)胞凋亡

HIE后腦細(xì)胞死亡不僅有壞死，細(xì)胞凋亡也是其主要損傷機(jī)制。早在1994年Mehmet等發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)宮內(nèi)窘迫或產(chǎn)時(shí)窒息的新生豬腦白質(zhì)中可發(fā)現(xiàn)許多凋亡小體，其數(shù)量與腦損傷程度、時(shí)間長短呈正相關(guān)，說明新生豬腦部缺氧缺血后出現(xiàn)的遲發(fā)細(xì)胞死亡機(jī)制中可能與細(xì)胞凋亡不適當(dāng)激活有關(guān)。

趙鳳艷等(2015年)在對LncRNA-BC088414的研究中發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血可引起腦組織中的LncRNA-BC088414表達(dá)上調(diào)，上調(diào)的BC088414可能通過Adrb2和Casp6的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重缺氧缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷；閻紅琳等(2016年)在對LncRNA-MEG3的研究中發(fā)現(xiàn)，其可能通過p53促進(jìn)細(xì)胞凋亡加重缺氧缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷；Zhang等[16]在對LncRNA-MALAT1研究中指出，其不僅在炎癥損傷中發(fā)揮作用，還可通過對凋亡因子Bim的抑制起抗凋亡作用，減少缺血性腦血管和實(shí)質(zhì)損傷。綜上，LncRNA可能通過促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡而調(diào)控HIE發(fā)生后腦損傷。

2.2 LncRNA在HIE神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)中的作用

目前認(rèn)為神經(jīng)系統(tǒng)受損后有不可再生性，人類神經(jīng)系統(tǒng)損傷后暫無已證明的有效療法，特別是新生兒缺氧缺血所致腦損傷，相對于成人缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)可致更嚴(yán)重后遺癥，包括智力低下、腦癱、癲癇等。

學(xué)者們對于神經(jīng)系統(tǒng)損傷后修復(fù)的研究主要集中在干細(xì)胞增殖、分化及神經(jīng)元軸突伸長等領(lǐng)域。Mercer等(2010年)在研究中發(fā)現(xiàn)LncRNA-Sox20t可通過調(diào)控Sox2的編碼基因調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化和神經(jīng)細(xì)胞的再生。Ng等(2013年)研究指出，LncRNA-RMST也可負(fù)向調(diào)節(jié)Sox2的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化。趙鳳艷等(2015年)研究表明，LncRNA不僅能夠調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的干性，還可通過調(diào)節(jié)下游靶蛋白的表達(dá)，促進(jìn)或抑制神經(jīng)再生。

LncRNA不僅可促進(jìn)或抑制神經(jīng)再生，還可通過調(diào)節(jié)缺血后腦血管的形成促進(jìn)缺血后腦損傷的修復(fù)。Uchida等(2004年)研究發(fā)現(xiàn)LncRNA可通過調(diào)控血管新生因素低氧誘導(dǎo)因子(HIF)、血管內(nèi)皮生長因子/血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF/VEGFR)、Ang/tie、Notch信號等參與調(diào)控血管新生。劉鵑等(2013年)在研究中發(fā)現(xiàn)LncRNA-meg3可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管等功能，進(jìn)而影響缺血后腦部血管新生。

3結(jié)語及展望

LncRNA不僅參與了人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能[18-19]，而且在許多疾病的進(jìn)展中起重要作用，因此其具有較大潛力成為多種人類疾病新治療靶點(diǎn)。LncRNA通過調(diào)控靶基因在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、損傷及修復(fù)等方面起著重要作用，然而由于LncRNA的復(fù)雜性，導(dǎo)致對大多數(shù)LncRNA在其中發(fā)揮的具體機(jī)制仍不清楚。因此，期望隨著芯片技術(shù)及高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，能夠成功地開發(fā)預(yù)測LncRNA結(jié)構(gòu)和功能的計(jì)算模型，隨著人們對LncRNA與新生兒缺氧缺血性腦損傷修復(fù)之間的因果關(guān)系和作用機(jī)制的深入研究，臨床上將可涌現(xiàn)出預(yù)診治HIE的新途徑，以減輕患兒家庭和社會所承受的沉重負(fù)擔(dān)。