周 鶴 張國(guó)利 傅志豐 許文蓓

（1.九江市食品藥品檢驗(yàn)所 江西九江 332000；2.九江市食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心）

1 前言

銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）又稱綠膿桿菌（以下簡(jiǎn)稱PA），是一種非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于水、土壤、空氣及動(dòng)物機(jī)體和皮膚中，對(duì)紫外線、消毒劑等不良環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，是一種重要的食源性條件致病菌，正常人不易感染，然而對(duì)于一些特殊人群，如術(shù)后病人以及嬰幼兒，如果接觸該菌易導(dǎo)致急性腸道炎、腦膜炎和敗血癥等疾病[1]，嚴(yán)重威脅人們的身體健康。

桶裝水是指采用自來(lái)水或地下水，經(jīng)過(guò)現(xiàn)代工業(yè)技術(shù)加工的純凈水或礦泉水。近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對(duì)食品的消費(fèi)要求也越來(lái)越高，桶裝水因其購(gòu)買、飲用便捷的特點(diǎn)，越來(lái)越受到大眾的歡迎。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年我國(guó)桶裝水消費(fèi)規(guī)模為2.9×1010元，2017年增長(zhǎng)至7.6×1010元，市場(chǎng)規(guī)模增加了1.6倍[2]。然而，在發(fā)展的同時(shí)，桶裝水也存在眾多問(wèn)題，近年來(lái)有關(guān)PA污染水的報(bào)道逐漸增多。2019年1月，《消費(fèi)者報(bào)道》顯示，2014年至2018年，國(guó)家及省級(jí)食品藥品監(jiān)督管理局共抽檢出2 350批次不合格的桶裝水，其中，1 551批次檢出PA，占比達(dá)60.8%[3]。2018年，九江市也抽檢桶裝水25批次，其中有13批次PA不合格。因此，PA是桶裝水最突出的質(zhì)量安全問(wèn)題。本文就其污染原因進(jìn)行闡述，并簡(jiǎn)要介紹了當(dāng)前水中PA檢測(cè)常用的幾種方法，為生產(chǎn)實(shí)踐提供理論技術(shù)支撐。

2 PA污染原因

2.1 水源污染

水源污染可能是桶裝水受PA污染的根本原因。桶裝水主要以自來(lái)水、井水或江河湖泉水作為水源。近年來(lái)，我國(guó)經(jīng)濟(jì)在高速發(fā)展的同時(shí)，存在各種工業(yè)廢水和生活污水未處理達(dá)標(biāo)就直接排放至水體的現(xiàn)象。據(jù)馬群飛等[4]的調(diào)查顯示，福建省投入生產(chǎn)的80處飲用天然礦泉水水源中，有18處檢出了PA，檢出率為23.08%。鄧梅清等[5]對(duì)南方地區(qū)45份進(jìn)行檢查，也發(fā)現(xiàn)有11份檢出PA，高于成品水的14.4%，其中在成品水檢出的4家中有3家水源受到污染。如果水源受到污染，后續(xù)工藝又無(wú)法將其去除，就容易產(chǎn)生持續(xù)性污染。

2.2 生產(chǎn)過(guò)程控制有待提高

桶裝水的生產(chǎn)工藝流程為：水源水→粗濾→精濾→去離子化→[離子交換、反滲透（適用于純凈水）及其他加工方法]→配料（適用于其他飲用水）→殺菌→灌裝封蓋[瓶（桶）及其蓋的清洗消毒]→燈檢→成品。在生產(chǎn)過(guò)程中儀器設(shè)備污染、殺菌工藝參數(shù)設(shè)置不當(dāng)、灌裝車間環(huán)境不達(dá)標(biāo)、人員操作不規(guī)范等都有可能導(dǎo)致產(chǎn)品檢測(cè)結(jié)果不合格。其中，前3點(diǎn)是生產(chǎn)過(guò)程中造成污染的主要因素。

2.2.1 儀器設(shè)備污染

水處理系統(tǒng)并不是完全密封的，水罐、砂罐和活性炭罐都通過(guò)呼吸器與外界相通，細(xì)菌很容易侵入管道系統(tǒng)。PA對(duì)環(huán)境耐受力強(qiáng)，迅速地黏附在水生產(chǎn)所用的器具如儲(chǔ)水罐、管道、灌裝機(jī)、濾膜和增壓泵上，簡(jiǎn)單的沖洗、常規(guī)的消毒技術(shù)難以對(duì)其清除。陳水仙等[6]對(duì)福建某企業(yè)桶裝水PA污染進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蓄水池中含有大量的PA，是該企業(yè)的原始污染源。在潮濕的環(huán)境下PA更易繁殖，隨著生產(chǎn)線進(jìn)入下一環(huán)節(jié)，并可能蔓延至全工序的管道、設(shè)備，造成交叉污染。除此之外，部分企業(yè)對(duì)石英砂、活性炭等過(guò)濾裝置長(zhǎng)期不清洗消毒，精濾過(guò)程的濾膜不及時(shí)更換，有的長(zhǎng)達(dá)5年未做任何清洗或更換，一旦污染難以消除。

2.2.2 殺菌工藝參數(shù)設(shè)置不當(dāng)

目前，桶裝水常采用通臭氧的方式消毒殺菌，通入臭氧能有效降低水中PA的濃度。然而，如果水中溴化物濃度過(guò)高，過(guò)量臭氧的通入將導(dǎo)致溴酸鹽超標(biāo)。張永清等[7]報(bào)道，隨著臭氧濃度和溴離子濃度的增加，水中溴酸鹽生成量增加；當(dāng)臭氧質(zhì)量濃度為0.4 mg/L、作用時(shí)間為5min時(shí)，選用的3種礦泉水的溴酸鹽含量均大于國(guó)標(biāo)要求10 μg/L。因此，企業(yè)為避免溴酸鹽超標(biāo)，必須降低臭氧的投加濃度和接觸時(shí)間，而PA對(duì)消毒劑的抵抗力遠(yuǎn)大于其他微生物[8]，當(dāng)水中PA含量較高時(shí)，容易造成殺菌不徹底的現(xiàn)象。

2.2.3 灌裝車間環(huán)境不達(dá)標(biāo)

《飲用水的生產(chǎn)許可證審查細(xì)則》對(duì)桶裝水的生產(chǎn)環(huán)境要求做了具體規(guī)定：灌裝車間空氣潔凈度須達(dá)到10 000級(jí)且局部應(yīng)達(dá)到100級(jí)，或整體潔凈度達(dá)到1 000級(jí)，然而許多企業(yè)空氣清潔度難以持續(xù)保持。另外，水生產(chǎn)車間環(huán)境潮濕、常有積水，容易滋生PA，并通過(guò)罐裝進(jìn)入水中。汪華等[9]調(diào)查了衡陽(yáng)市周邊43家桶裝飲用水工廠灌裝間及其他主要生產(chǎn)環(huán)節(jié)PA污染情況，發(fā)現(xiàn)罐裝車間普遍存在污染，PA檢出率為83.7%，顯著高于其他生產(chǎn)環(huán)節(jié)。

2.2.4 人員操作不規(guī)范

生產(chǎn)人員如果沒(méi)有養(yǎng)成一個(gè)良好的操作習(xí)慣，違反規(guī)定洗手、更衣、消毒，或者手直接與水或者包裝材料接觸，都可能將PA帶入產(chǎn)品中。由于PA對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，在桶中繁殖更容易導(dǎo)致產(chǎn)品不合格。

2.3 包裝材料清洗消毒不徹底

包裝材料清洗消毒不徹底是桶裝水受污染的又一重要因素。目前，生產(chǎn)企業(yè)一般對(duì)水桶進(jìn)行回收再利用，但桶的特殊構(gòu)造，不利于清洗和消毒，加上大部分企業(yè)缺乏清洗水桶的專用設(shè)備，采用人工進(jìn)行清洗。在灌裝前如消毒劑濃度過(guò)低或消毒時(shí)間不夠，或消毒方法不當(dāng)，不能有效地殺滅微生物，都可能導(dǎo)致桶內(nèi)PA殘留造成交叉污染。鐘菲菲等[10]對(duì)水源、生產(chǎn)工藝、儲(chǔ)存容器和生產(chǎn)環(huán)境等環(huán)節(jié)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示清洗消毒的水桶是成品水PA污染的原因。另外，有些小企業(yè)生產(chǎn)工藝落后，仍手工灌裝封蓋，也可能使包裝材料受到污染。

2.4 企業(yè)食品安全意識(shí)不強(qiáng)，出廠檢驗(yàn)如同虛設(shè)

桶裝水生產(chǎn)工藝較簡(jiǎn)單，且運(yùn)輸成本高、保質(zhì)期短，因此絕大多數(shù)企業(yè)分布在各市縣，以所在行政區(qū)內(nèi)的市場(chǎng)為主。很多企業(yè)都是中小型企業(yè)，設(shè)備簡(jiǎn)陋，條件粗放，檢驗(yàn)人員技術(shù)能力有待完善，造成出廠檢驗(yàn)如同虛設(shè)，無(wú)法發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量問(wèn)題，部分企業(yè)產(chǎn)品甚至未經(jīng)檢驗(yàn)直接流入市場(chǎng)，造成一定的安全隱患。

2.5 運(yùn)輸儲(chǔ)藏控制不當(dāng)

桶裝水桶蓋的材料來(lái)源廣泛，很多企業(yè)為了節(jié)約成本，采用回收的廢舊聚乙烯（PE）材料制作，造成桶蓋質(zhì)量欠佳，彈性和密封性差，在運(yùn)輸、流通過(guò)程中易造成提拉松動(dòng)而漏水，產(chǎn)品易受到空氣中PA的污染。另一方面，桶裝水一般有數(shù)月的保質(zhì)期，企業(yè)剛生產(chǎn)的水中無(wú)銅綠假單孢菌或有極少含量，但在運(yùn)輸儲(chǔ)藏過(guò)程中，尤其是夏秋季節(jié)（溫度較高，適合銅綠假單胞菌生長(zhǎng)），迅速自行增殖至1×104CFU/mL，造成產(chǎn)品飲用水的不合格[11]。

3 銅綠假單胞菌檢測(cè)方法

水中銅綠假單胞菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法和新興快速檢測(cè)方法2類，其中傳統(tǒng)培養(yǎng)法主要是GB 8538—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》[12]中的濾膜法；新興快速檢測(cè)方法主要包括PCR法和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）等。傳統(tǒng)培養(yǎng)法實(shí)用性、準(zhǔn)確性強(qiáng)，是國(guó)標(biāo)通用的方法，但存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，且后續(xù)生化試驗(yàn)煩瑣，不能實(shí)現(xiàn)批量產(chǎn)品快速檢測(cè)；新興快速檢測(cè)方法快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便省時(shí)，然而也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。

3.1 國(guó)標(biāo)濾膜法

國(guó)標(biāo)濾膜法是通過(guò)一定的培養(yǎng)，觀察微生物的形態(tài)特征，將疑似菌落進(jìn)行生化鑒定實(shí)驗(yàn)以確定結(jié)果。該方法實(shí)驗(yàn)條件要求不高，可以較直觀地觀察結(jié)果，適合基層實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。具體操作過(guò)程為：將250mL水樣用0.45 μm濾膜過(guò)濾，然后將濾膜貼至CN瓊脂平板上，于36℃培養(yǎng)48 h后對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察。銅綠假單胞菌在CN平板上有3種形態(tài)：（1）藍(lán)色或綠色菌落，按照GB/T 8538—2008《飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》[13]的方法可以直接判定檢出，然而現(xiàn)行國(guó)標(biāo)需進(jìn)行綠膿菌素驗(yàn)證；（2）產(chǎn)熒光非藍(lán)綠色菌落，需進(jìn)行產(chǎn)氨試驗(yàn)，若產(chǎn)氨實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，則判定樣品為陽(yáng)性；（3）紅褐色不發(fā)熒光菌落，此時(shí)需進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)、產(chǎn)氨試驗(yàn)和金氏B試驗(yàn)，如三者均為陽(yáng)性，則樣品為陽(yáng)性。

3.2 PCR法（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）

PCR技術(shù)是在體外合適條件下，以DNA為模板，以一對(duì)人工合成的寡核苷酸為引物，在耐熱DNA聚合酶作用下特異性擴(kuò)增目的DNA片段的技術(shù)。應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)食源性致病菌分為常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR等，為了提高檢測(cè)靈敏度，可采用一定的增菌方式提高目標(biāo)DNA片段的濃度。張淑紅等[14]建立了常規(guī)PCR技術(shù)檢測(cè)桶裝水銅綠假單胞菌的方法，該方法包括過(guò)濾、增菌、過(guò)濾、提取DNA、電泳等步驟，整個(gè)操作過(guò)程僅約需要22 h，然而無(wú)法區(qū)分活細(xì)菌和死細(xì)菌，容易造成假陽(yáng)性。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，陸星羽等[15]添加10μg/mL疊氮溴乙錠（EMA），既能有效抑制死菌PCR又不影響活菌PCR，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了對(duì)水中活菌的檢測(cè)。相比常規(guī)PCR法，熒光定量PCR技術(shù)在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)或染料，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱反映擴(kuò)增過(guò)程中模板濃度變化，具有更強(qiáng)的檢測(cè)靈敏度和特異性。楊滴等[16]建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)礦泉水中的銅綠假單胞菌，根據(jù)外毒素A基因片段設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和一個(gè)TaqMan探針，特異性較好，檢測(cè)靈敏度為1×103CFU/mL。Ezra Orlofsky等[17]采用MPN 計(jì)數(shù)結(jié)合q-PCR對(duì)污水中銅綠假單胞菌落進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度提高至5 CFU/L。

3.3 LAMP檢測(cè)法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是由 Notomi等[18]開(kāi)發(fā)的新型核酸擴(kuò)增方法。該方法成本低，可在短時(shí)間內(nèi)完成擴(kuò)增，省時(shí)且無(wú)需大型專業(yè)設(shè)備，只需一臺(tái)溫控設(shè)備，是繼PCR法后倍受青睞的檢測(cè)技術(shù)。劉芳等[19]以基因ETA為靶基因，針對(duì)銅綠假單胞菌6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立水中銅綠假單胞菌的LAMP法，發(fā)現(xiàn)該法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢驗(yàn)結(jié)果一致，但檢驗(yàn)時(shí)間只需2h，并且可通過(guò)目測(cè)反應(yīng)體系濁度變化或顯色反應(yīng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷。曹科峰等[20]以gbca基因?yàn)槟０澹捎秒娔X在線設(shè)計(jì)引物，利用反應(yīng)體系的顏色變化及瓊脂糖凝膠電泳的差異，建立了銅綠假單胞菌的LAMP檢測(cè)法，與PCR法相比，檢測(cè)靈敏度提高了約9倍。

4 結(jié)語(yǔ)

桶裝水銅綠假單菌污染問(wèn)題與人們的生命健康息息相關(guān)，對(duì)其控制須從水源保護(hù)、加強(qiáng)生產(chǎn)流通各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制做起。監(jiān)管部門(mén)應(yīng)加大對(duì)桶裝水的抽檢力度，尤其是夏秋季節(jié)，要采用科學(xué)準(zhǔn)確的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)微生物污染情況，保證消費(fèi)者的飲水安全。