劉 穎， 徐薇薇， 郭 平， 林建國

(1. 中國航海學(xué)會(huì)，北京 100013； 2. 大連海事大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116026)

日益頻發(fā)的海洋溢油事故使海洋環(huán)境遭到嚴(yán)重的破壞[1]，發(fā)生在低溫條件下的溢油事故往往危害更大。[2]1989年3月24日，Exxon Valdez油船在阿拉斯加州美、加交界的威廉王子灣附近觸礁，約1 700 km的海岸帶被污染，大約有10萬～30萬只鳥[3]和大量海獺、海豹、禿鷹、鮭魚和鯡魚死亡[4]，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的影響至今還沒有完全消除。[5]我國北方海區(qū)是重要的石油開發(fā)區(qū)，隨著海上石油平臺(tái)和油碼頭的陸續(xù)投產(chǎn)，往來船舶大量增加，成為溢油事故的多發(fā)區(qū)。海水溫度較低時(shí)，在我國北方海域也曾發(fā)生多起溢油事故，如1983年11月25日發(fā)生的“東方大使”輪觸礁事故[6]、2004年11月28日發(fā)生的“錦集7”沉船事故[7]和2002年11月23日發(fā)生的“塔斯曼?！庇痛鲎彩鹿蔥8]。這些事故發(fā)生時(shí)海水溫度較低，不利于對(duì)石油污染的清除，對(duì)海洋環(huán)境造成嚴(yán)重危害。因此，研究低溫時(shí)石油污染的處理方法對(duì)保護(hù)我國北方海域十分必要。

常用的處理石油污染的方法有物理方法、化學(xué)方法和生物方法，其中生物方法具有安全、高效、無二次污染、不需大型設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。[9]但是在低溫條件下，石油烴的生物可利用性降低。[10]盡管低溫不利于石油烴的生物降解，但自然界存在能夠降解石油烴的低溫石油降解菌[11-14]，并且有些低溫菌能夠通過產(chǎn)生生物表面活性劑來提高石油烴的生物可利用率。[15]生物表面活性劑同時(shí)具有親水基和疏水基，能顯著降低油/水界面張力[15-17]，促進(jìn)石油烴溶解、乳化、分散等，提高石油污染生物修復(fù)的效率。[17-19]同時(shí)，生物表面活性劑具有對(duì)環(huán)境影響小、可原位生成等優(yōu)勢(shì)，適用于環(huán)境修復(fù)。

目前對(duì)產(chǎn)生表面活性劑的海洋石油降解菌的研究主要集中在常溫菌，對(duì)低溫菌的研究較少，特別是對(duì)篩選自海洋環(huán)境的表面活性劑的低溫菌株研究非常少。[20-21]本研究利用篩選自我國北方海域的石油降解菌進(jìn)行生物表面活性劑的制備，并對(duì)所產(chǎn)生的生物表面活性劑的性能進(jìn)行研究。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與菌株

試驗(yàn)中用到兩種液體培養(yǎng)基：MMC培養(yǎng)基和2216E培養(yǎng)基。

1) MMC培養(yǎng)基組分：NaCl，24 g；NH4NO3，1.0 g；KCl，0.7 g；KH2PO4，2.0 g；Na2HPO4，7.563 4 g； MgSO4·7H2O，7.0 g；微量元素；去離子水，1 000 mL；pH值為7.4，在121 ℃下高壓滅菌20 min。

2) 2216E液體培養(yǎng)基組分：蛋白胨，5 g；磷酸高鐵，0.1 g；酵母膏，1 g；去離子水，1 000 mL；pH值7.4～7.8，在121 °C下高壓滅菌20 min。

試驗(yàn)菌株為實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有菌株。該菌株分離自大連近岸海域表層海水，經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序方法鑒定該菌株屬于鹽單胞菌屬(Halomonas)，命名為Halomonassp.DH1。該菌株能在低溫下降解石油烴，在10 ℃下降解培養(yǎng)60 d后，菌株對(duì)原油的降解率可達(dá)49.7%。

1.2 Halomonas sp.DH1的培養(yǎng)

用無菌接種環(huán)挑取純化后的菌株至裝有100 mL已滅菌的2216E液體培養(yǎng)基的三角瓶錐形中，低溫振蕩培養(yǎng) 3 d(10 ℃，120 r/min)形成降解菌母液。

1.3 Halomonas sp.DH1利用不同碳源產(chǎn)表面活性劑

分別利用葡萄糖、正十六烷、柴油、原油、石蠟、菲、萘、芘為碳源，考察Halomonassp.DH1利用不同碳源產(chǎn)表面活性劑的情況。

按照5%(體積分?jǐn)?shù))的比例將降解菌母液移至已滅菌的MMC液體培養(yǎng)基中，然后分別加入1%(體積分?jǐn)?shù)或質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碳源。在10 ℃條件下低溫振蕩培養(yǎng)20 d。以不接種降解菌的培養(yǎng)液作為空白組。

降解培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液離心去除菌體后用鹽酸調(diào)節(jié)至 pH = 2.0，在4 ℃下冷藏過夜。使用表面張力儀測(cè)定發(fā)酵液的表面張力。在試管中加入6 mL離心去菌后的發(fā)酵液和4 mL柴油，渦旋振蕩2 min，靜置24 h后測(cè)量乳化層高度和總高度。乳化指數(shù)(E24)=乳化層高度/總高度。

1.4 用Halomonas sp.DH1制備生物表面活性劑

按照5%(體積分?jǐn)?shù))的比例將降解菌母液移至含有1%(體積分?jǐn)?shù))柴油的MMC液體培養(yǎng)基中，在10 ℃條件下低溫振蕩培養(yǎng)20 d。發(fā)酵液離心去除菌體后用鹽酸調(diào)節(jié)至pH=2.0，在4 ℃下冷藏過夜。用氯仿-甲醇(2∶1，體積分?jǐn)?shù))混合液萃取發(fā)酵液中的表面活性劑，將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到物質(zhì)為生物表面活性劑。

1.5 生物表面活性劑的性能

1.5.1對(duì)柴油生物降解的促進(jìn)作用

按照5%(體積分?jǐn)?shù))的比例將降解菌母液移至含有1%(體積分?jǐn)?shù))柴油和5%(體積分?jǐn)?shù))生物表面活性劑的MMC液體培養(yǎng)基中，在10 ℃條件下低溫振蕩培養(yǎng)20 d。以不加生物表面活性劑的培養(yǎng)液作為對(duì)照。

降解培養(yǎng)結(jié)束后，用石油醚萃取發(fā)酵液中殘余的石油烴，在波長225 nm下采用紫外分光光度法測(cè)定石油烴含量。將水相稀釋5倍后在波長600 nm下采用可見光分光光度法測(cè)菌株生長情況。

1.5.2對(duì)黏附在沙子上原油的洗脫作用

將1.5 g原油加入到裝有7.5 g沙子(沙子取自大連市星海浴場(chǎng)沙灘)的三角瓶中，振蕩使原油與沙子充分混勻，放入干燥箱后烘干3 d。取20 mL 濃度為0.1 g/L的生物表面活性劑溶液加入到裝有含油沙子的三角瓶中。將三角瓶充分振蕩后倒掉水相，放入干燥箱后烘干，稱重。對(duì)照組用20 mL 去離子水代替生物表面活性劑溶液。

原油的洗脫率=(洗脫的原油重量/黏附的原油重量)×100%。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 Halomonas sp.DH1利用不同碳源產(chǎn)表面活性劑

菌株Halomonassp.DH1利用不同碳源的發(fā)酵液的表面張力和E24見圖1。試驗(yàn)結(jié)果表明Halomonassp.DH1菌株以正十六烷、液體石蠟、柴油為碳源的情況下，發(fā)酵液的表面張力較低，其中以正十六烷為唯一碳源的發(fā)酵液可將表面張力降低至28.4 mN/m。以葡萄糖、正十六烷和萘為碳源時(shí)發(fā)酵液的乳化性能較好，E24分別達(dá)到60.1%和51.1%。這說明菌株Halomonassp. DH1以這些物質(zhì)為碳源進(jìn)行發(fā)酵所得的發(fā)酵產(chǎn)物具有得到較好的表面活性。

許多菌株能夠利用不同的碳源產(chǎn)生表面活性劑，例如VARJANI等[22]學(xué)者研究菌株P(guān)seudomonas aeruginosa NCIM 5514對(duì)不同碳源的利用情況：該菌株在利用柴油、原油、甘油和葡萄糖為碳源時(shí)發(fā)酵液的表面張力顯著降低，分別為38.00 mN/m、36.70 mN/m、34.95 mN/m和29.42 mN/m；在利用甘油和葡萄糖為碳源時(shí)發(fā)酵液的乳化性能較好，E24分別達(dá)到75.0%。研究目的的不同對(duì)碳源的選擇也不同。研究生物表面活性劑原位生成時(shí)往往選用原油、燃料油、柴油等碳源，研究生物表面活性劑生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性時(shí)往往選用廢油或其他價(jià)格較低的碳源。

2.2 用Halomonas sp.DH1制備生物表面活性劑

在柴油降解的初期，搖瓶內(nèi)的柴油呈膜狀漂浮在水面上，水相澄清。隨著時(shí)間的延長，水相開始逐漸變渾濁，柴油呈油滴狀。隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長，柴油液滴越來越小直至液面上無明顯油滴，液相呈乳白色。發(fā)酵液離心去除菌體后用鹽酸調(diào)節(jié)至pH=2.0，在4 ℃下冷藏過夜，無沉淀產(chǎn)生。用氯仿-甲醇(2∶1，體積分?jǐn)?shù))混合液萃取發(fā)酵液中的表面活性劑，將萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到物質(zhì)為棕黃色粉末。

目前生物表面活性劑的制備方法主要有微生物發(fā)酵法和酶合成法，由于生物表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)種類相對(duì)較多而且比較復(fù)雜，傳統(tǒng)的化學(xué)方法不容易合成。

2.3 生物表面活性劑的性能

2.3.1對(duì)柴油生物降解的促進(jìn)作用

降解培養(yǎng)結(jié)束后，加入表面活性劑的搖瓶內(nèi)溶液較未加入表面活性劑的溶液更加渾濁。試驗(yàn)結(jié)果見圖2，可見加入表面活性劑明顯促進(jìn)菌株的生長和對(duì)柴油的降解效果。加入表面活性劑的搖瓶內(nèi)柴油的生物降解率比未加入表面活性劑的高22.3%。

許多研究表明加入生物表面活性劑能促進(jìn)石油烴的降解，主要是由于生物表面活性劑降低難溶的石油烴與水之間的界面張力， 有利于石油烴的分散、乳化和溶解，增大相界面面積, 便于石油降解菌和油滴之間直接接觸， 加速石油烴向細(xì)胞中的擴(kuò)散和被同化分解。[23]

2.3.2對(duì)原油的洗脫作用

Halomonassp.DH1所產(chǎn)生的生物表面活性劑能顯著洗脫沙子上黏附的石油烴。洗脫前后的照片見圖3，可見使用生物表面活性劑洗脫原油后，大部分黏附在沙子上的原油被洗脫，沙子露出本色，溶液渾濁，而使用去離子水洗脫原油后，沙子依然黏附黑色原油，水相較澄清。用20 mL濃度為1 g/L的生物表面活性劑溶液可將沙子上黏附的原油洗脫82.1%，而在同等條件下使用去離子水僅可洗脫掉11.7%的原油，可見加入生物表面活性劑顯著促進(jìn)了原油的洗脫效率，見圖4。說明菌株Halomonassp.DH1所產(chǎn)生的生物表面活性劑具有應(yīng)用于潮間帶石油污染生物修復(fù)的潛力。

a) 用去離子水洗脫b) 用表面活性劑溶液洗脫

圖3 原油的洗脫效果照片

3 結(jié)束語

本研究對(duì)海洋低溫石油降解菌Halomonassp.DH1產(chǎn)生物表面活性劑的性能進(jìn)行了研究。試驗(yàn)結(jié)果表明：在低溫下菌株Halomonassp.DH1可利用多種碳源產(chǎn)生表面活性劑，產(chǎn)生的生物表面活性劑可顯著促進(jìn)石油烴的降解和洗脫。因此，該菌株具有應(yīng)用于我國北方海域冬季溢油生物修復(fù)工作的潛力。

本研究的結(jié)果可以為海洋溢油的微生物修復(fù)提供優(yōu)良菌源和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但論文中很多的研究工作還處于初始階段，未來應(yīng)進(jìn)一步深化研究。