李良廣, 朱鳴鶴, 熊志松， 錢 程

(寧波大學(xué) 海運(yùn)學(xué)院， 浙江 寧波 315211)

21世紀(jì)以來，世界各國貿(mào)易發(fā)展迅猛，船舶進(jìn)出港口頻繁，由壓載水隨意排放引發(fā)的海洋生態(tài)環(huán)境惡化、物種變異甚至生物入侵等一系列問題， 已被全球環(huán)境聯(lián)合會(huì)(Global Environment Facility, GEF)認(rèn)定為世界海洋的四大威脅之一。[1]據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年至少有超過7 000種海洋動(dòng)物、植物以及病原微生物隨壓載水轉(zhuǎn)運(yùn)至世界各地。[2]而在各入侵的物種中，壓載水微生物以其流動(dòng)性強(qiáng)、變化規(guī)律復(fù)雜以及不能及時(shí)有效處理的特性對(duì)入侵環(huán)境構(gòu)成更嚴(yán)重的威脅。目前對(duì)壓載水的調(diào)查研究工作已逐漸深入。文獻(xiàn)[3]～文獻(xiàn)[6]對(duì)壓載水中藻類、細(xì)菌與鹽度、溶解氧、溫度及pH等環(huán)境因子分別展開有針對(duì)性的研究；挪威水研究所(Norwegian Institute for Water Research, NIVA)在對(duì)壓載水進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)壓載水中存在一些致病菌生存能力非常強(qiáng)，7 a后仍能表現(xiàn)出毒性[7]；李春麗等[8]在對(duì)到達(dá)寧波港的多艘船舶進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)包括副溶血性弧菌在內(nèi)的多種致病菌。RUIZ等[9]研究發(fā)現(xiàn)沿海生態(tài)系統(tǒng)的入侵物種中，細(xì)菌和病毒的入侵成功幾率遠(yuǎn)高于其他微生物。這些研究結(jié)果均證明了壓載水中存在著大量的致病菌，并已對(duì)沿海地區(qū)人體健康以及生態(tài)環(huán)境構(gòu)成巨大威脅。李云峰等[10]在對(duì)船舶壓載艙沉積物進(jìn)行檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)在所檢出的12種細(xì)菌中大多具有致病性；REVILLACASTELLANOS等[11]和MIMURA等[12]在各自的研究中發(fā)現(xiàn)大量的潛在致病菌存在于壓載艙底層的沉積物中。這些研究都表明了底層壓載水及其沉積物中致病菌的數(shù)量以及檢出率不同于其他水層且均處于較高水平，但對(duì)壓載水微生物的聚集情況的研究多側(cè)重于浮游生物[13]，對(duì)壓載水中致病菌在航行中數(shù)量以及分布特征變化情況也鮮有報(bào)道。

隨著《船舶壓載水及沉積物控制和管理國際公約》(以下簡稱“壓載水公約”)于2016年11月24日正式生效，其對(duì)含有常見致病菌(大腸埃希菌、副溶血性弧菌、霍亂弧菌)的壓載水的排放制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，這對(duì)我國的壓載水的管理提出了更高要求，所以對(duì)壓載水的系統(tǒng)性研究迫在眉睫。本文通過研究壓載水中3種常見致病菌的垂直分布特征及與水齡的關(guān)系，為壓載水生物入侵風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)、物種快速檢測方法研究以及壓載水處理設(shè)備研發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

采自2016年3月至2016年8月進(jìn)入上海港的DEMETER、LISA和TINA 3艘分別裝自地中海、印度洋和波斯灣3個(gè)海域的國際船舶的7個(gè)水艙的壓載水水樣見表1。

表1 采樣船舶統(tǒng)計(jì)

1.2 方法

本文根根“壓載水公約”的相關(guān)規(guī)定，采用10倍稀釋涂布平板劃線法，將樣品中的致病菌培養(yǎng)成菌落，通過菌落的不同特征確定對(duì)應(yīng)致病菌的種類，通過觀察菌落的數(shù)量來完成對(duì)致病菌快速準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。

由于不同壓載艙水深不同，按照水深分成A、B、C等3類。A類壓載艙包括D1和D2，B類艙包括L1、L2、L3，C類艙包括T1和T2。各艙由壓載水表面至艙底的20個(gè)不同深度點(diǎn)進(jìn)行采樣，每個(gè)點(diǎn)采集5～15 L水樣，測試水溫?，F(xiàn)場取5～8 L不等，使用15 μm孔徑的篩絹進(jìn)行過濾，水質(zhì)澄清后灌入采樣瓶，密封并帶回實(shí)驗(yàn)室處理。采樣船舶情況如表1所示。

在實(shí)驗(yàn)室中取得壓載水樣品之后，對(duì)其進(jìn)行1∶10稀釋，得到稀釋溶液(盡量使得樣品中的細(xì)菌細(xì)胞分散開，即成為單個(gè)細(xì)胞存在，以保證1個(gè)菌落代表1個(gè)細(xì)胞)，從稀釋溶液中抽取一定量的稀釋液接種到平板中，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)。培養(yǎng)8 h后，形成菌落，通過統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目，即可計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)量。另外根據(jù)不同的細(xì)菌形成菌落后存在的明顯差異，可通過對(duì)菌落的形態(tài)特征觀察對(duì)比來判斷出細(xì)菌的種類。

經(jīng)過對(duì)文獻(xiàn)研讀以及資料查找，獲取了大腸桿菌菌落、副溶血性弧菌菌落和霍亂弧菌菌落的形態(tài)特征資料。

1) 大腸桿菌菌落：菌落邊緣整齊，圓形，表面有光澤，濕潤，光滑，呈灰白色。

2) 副溶血性弧菌菌落：圓形，邊緣整齊，濕潤，稍渾濁，半透明，多數(shù)具有尖心、斗笠裝，藍(lán)綠色菌落，直徑為2～4 mm。

3) 霍亂弧菌菌落：菌落為黃色，扁平，直徑約為2～3 mm。

4) 重復(fù)試驗(yàn)過程，能夠獲取不同水深的壓載水中致病菌在不同水齡中的種類和數(shù)量數(shù)據(jù)。

采用ORIGIN 9.1軟件進(jìn)行繪圖。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)3種致病菌數(shù)量分布與水齡做相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 3種致病菌在壓載艙中的檢出情況

根據(jù)不同水深，淺層壓載水A類艙取水深0～2 m，B類艙取水深度0～1 m，C類艙取水深度0～0.8 m；中層壓載水A類艙取水深度4～6 m，B類艙取水深度2～3 m，C類艙取水深度1.6～2.4 m；深層壓載水A類艙取水深度8～10 m，B類艙取水深度4～5 m，C類艙取水深度3.2～4.0 m。檢測發(fā)現(xiàn)，隨著水深的增加，各致病菌的檢出率也呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，尤其是在對(duì)底層壓載水進(jìn)行檢測時(shí)，3種致病菌的檢出率明顯增加。其中大腸埃希菌和副溶血性弧菌的檢出率更明顯地表現(xiàn)出這一趨勢(shì)，底層壓載水檢出率分別為56%和32%，而霍亂弧菌的檢出率明顯低于前兩者，且受深度的影響不明顯。檢出率情況見表2。

表2 3種致病菌在不同水深的檢出率 %

壓載水及其沉積物中的生物種類組成及豐度情況與載入壓載水的海域中生物種類和豐度情況密切相關(guān)[14]，據(jù)此來看本研究中3艘貨船壓載水的載入點(diǎn)水域中含有數(shù)量較多的大腸桿菌和副溶血性弧菌以及數(shù)量較少的霍亂弧菌，見圖1。此外，這可能也與壓載艙內(nèi)的生存環(huán)境更有利于大腸埃希菌和副溶血性弧菌這些優(yōu)勢(shì)種群的生存，從而擠壓霍亂弧菌的生存空間有關(guān)。

在對(duì)各船舶進(jìn)行跟蹤研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)壓載艙在載入壓載水前未將原先的壓載水完全排除，但仍有少量殘留物，通過采樣分析可知：殘留物中3種致病菌數(shù)量總體較少(見表3)，如D1中3種致病菌的數(shù)量分別為大腸埃希菌3.9×104cfu/mL、副溶血性弧菌2.3×103cfu/mL、霍亂弧菌2.1×103如表3所示，而與新載入壓載水后3種致病菌的數(shù)量(大腸埃希菌7.23×105cfu/mL、副溶血性弧菌1.79×105cfu/mL、霍亂弧菌1.52×104cfu/mL)相比明顯不在同一量級(jí)上。因此，本次試驗(yàn)就數(shù)量而言，殘留物的中細(xì)菌不會(huì)對(duì)本次試驗(yàn)構(gòu)成明顯的影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)依然能反映其分布特征及與水齡的關(guān)系。

表3 以往殘留物中致病菌數(shù)量 cfu/mL

2.2 3種致病菌在壓載艙中的垂直分布

以往研究中發(fā)現(xiàn)封閉陰暗的壓載水環(huán)境中水齡為10 d時(shí)，細(xì)菌豐度的變化已趨于穩(wěn)定，且5～10 d時(shí)壓載水中的浮游植物大部分已死亡或進(jìn)入休眠狀態(tài)[15-16]，根據(jù)這一結(jié)論，本研究以水齡10 d為時(shí)限。

如圖1所示，壓載艙L1中：水深0.5 m時(shí)大腸埃希菌4.76×104cfu/mL，副溶血性弧菌3.72×104cfu/mL，但為未檢出霍亂弧菌；水深5 m時(shí)壓載水出大腸埃希菌1.58×105cfu/mL，副溶血性弧菌8.89×104cfu/mL，霍亂弧菌1.78×104cfu/mL。數(shù)據(jù)顯示出個(gè)壓載艙中各水深菌落數(shù)量變化明顯且深層水樣中的數(shù)量明顯高于表層壓載水，并且壓載艙L2、L3、T1以及T2均可反映出此態(tài)勢(shì)，即隨著水深的增加，三種致病菌數(shù)量都呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)見表4。此外，從表4可看出：3種致病菌數(shù)量垂向分布與水深呈顯著正相關(guān)(D1、D2除外)，這也與REVILLACASTELLANOS與MIMURA發(fā)現(xiàn)大量的潛在致病菌存在于壓載艙底層的沉積物中這一結(jié)論相符。[11-12]

b) D2c) L1

d) L2e) L3

f) T1g) T2

圖1 10 d時(shí)3種致病菌在壓載艙中的垂直分布

表4 3種致病菌與水深的相關(guān)性

需要注意的是，壓載艙D1和D2中的檢測結(jié)果并未嚴(yán)格顯現(xiàn)出“隨著水深的增加，細(xì)菌數(shù)量逐漸增加”的規(guī)律，且與水深的相關(guān)性不明顯，如圖1所示，壓載艙D1中：水深1 m時(shí)大腸埃希菌8.03×105cfu/mL，副溶血性弧菌2.09×105cfu/mL，霍亂弧菌2.11×104cfu/mL；水深10m時(shí)大腸埃希菌8.26×105cfu/mL，副溶血性弧菌1.96×105cfu/mL，霍亂弧菌1.93×104cfu/mL。從對(duì)置換壓載水中致病菌的研究可知，這些存在于壓載水中的大量攝食細(xì)菌的浮游生物一旦經(jīng)過大洋置換排出壓載艙，壓載艙中的細(xì)菌豐度將會(huì)明顯增加。[14]經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這可能與DEMETER在靠泊新加坡港時(shí)應(yīng)港方要求，對(duì)這兩個(gè)壓載艙中的壓載水進(jìn)行了大洋置換有關(guān)，此時(shí)距壓載艙D1和D2發(fā)生置換的時(shí)間僅為3 d。通過對(duì)經(jīng)過大洋置換和沒有經(jīng)過大洋置換的壓載水中致病菌的研究，SEIDEN等[17]發(fā)現(xiàn)，存在于壓載水中的大量攝食細(xì)菌的浮游生物，一旦經(jīng)過大洋置換被排出壓載艙，壓載艙中的細(xì)菌豐度將會(huì)明顯增加。這可能是壓載艙D1和壓載艙D2中3種致病菌顯著高于其他壓載艙的原因。此外，壓載水的置換行為攪動(dòng)了艙中原有的水體，對(duì)壓載水溫度、pH、溶解氧等環(huán)境因子產(chǎn)生影響，繼而使壓載水發(fā)生置換后的短時(shí)間內(nèi)，細(xì)菌的活躍性增加，淺中層水深的細(xì)菌數(shù)量上升。

從圖1和表4可知：除經(jīng)過大洋置換的壓載水中3種致病菌的垂直分布與其他壓載艙明顯不同外，其他各壓載艙中3種致病菌的垂直分布狀況基本相同，即隨著壓載水深度的增加菌落數(shù)量逐漸增加，且在各水深中3種致病菌數(shù)量均是大腸埃希菌最多，副溶血弧菌次之，霍亂弧菌最少。

2.3 3種致病菌與水齡的關(guān)系

檢測發(fā)現(xiàn)，各壓載艙中底層壓載水中存有數(shù)量最多的致病菌，且隨著水齡的增加其數(shù)量變化明顯，故在研究中著重觀測底層壓載水。

如圖2所示，隨著水齡的增加，底層壓載水3種致病菌數(shù)量均發(fā)生明顯的變化，其中B、C類壓載艙在航行中并未發(fā)生置換，菌落數(shù)量一直呈明顯增加的狀態(tài)，而在水齡超過10 d時(shí)其數(shù)量已趨于穩(wěn)定，如L3在水齡為1、5、10、15 d時(shí)大腸埃希菌分別為1.22×105cfu/mL、1.69×105cfu/mL、2.17×105cfu/mL、2.17×105cfu/mL；A類艙在第7 d時(shí)發(fā)生置換，其菌落數(shù)量發(fā)生明顯變化，如D1在水齡為6、7 d時(shí)大腸桿菌分別為8.54×105cfu/mL、6.72×105cfu/mL，在所觀測的15 d中A類艙在置換前后類似于B類、C類艙前期逐漸增加的趨勢(shì)。

隨著水齡的增加，3種致病菌與水深的正相關(guān)性均逐漸增強(qiáng)。水齡較小時(shí)，壓載水中的活體生物死亡較少，細(xì)菌分布隨水深變化表現(xiàn)出的相關(guān)性不明顯。但由于壓載艙的相對(duì)封閉，以及水齡的增加在壓載艙中逐漸形成一低溶解氧環(huán)境，致使壓載水中大量活體生物死亡并沉于壓載艙底部，而大腸埃希菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌又通常以這些生物體為載體，故致病菌數(shù)量隨水深逐漸增加，見圖3。

船舶在港口排放壓載水時(shí)不會(huì)完全排空，而是根據(jù)船舶的穩(wěn)定性以及裝貨的情況進(jìn)行排放，即使是完全排放，艙底也會(huì)約有5%的壓載水殘留。因此，將有一定數(shù)量的壓載水經(jīng)過多次排放后仍殘留在壓載艙中。船舶在航行過程中，壓載水中的溶解氧及營養(yǎng)物質(zhì)被其中的生物逐漸消耗，壓載艙中并未設(shè)置專有的空氣流通途徑，只能通過壓載艙頂部設(shè)置的通風(fēng)口和測量孔與外界連接，死亡生物體腐爛被微生物分解，產(chǎn)生CO2等物質(zhì)，這些促使壓載水中各類化學(xué)物質(zhì)的種類和濃度不斷進(jìn)行著復(fù)雜的變化，艙內(nèi)環(huán)境的變化可能會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致微生物的種類和數(shù)目發(fā)生變化。[18]但在長期觀測一條船舶的壓載水的過程中SEIDEN等[17]發(fā)現(xiàn)一些危害人體的致病菌能長期存活于惡劣的壓載水環(huán)境中，且隨著時(shí)間的推移，沒有呈現(xiàn)出減少的趨勢(shì)，反而會(huì)出現(xiàn)數(shù)量增加的情況。[16]

研究中水齡最大的為25 d，這與其他水齡為10 d時(shí)的樣本中檢測出的各致病菌的數(shù)量基本在一個(gè)量級(jí)上，這可能是因?yàn)樗g為10 d時(shí)壓載艙內(nèi)的環(huán)境變化已趨于穩(wěn)定，致病菌的各生物活動(dòng)也趨于穩(wěn)定。此外，該研究對(duì)壓載艙新加裝的壓載水進(jìn)行15 d的跟蹤檢測發(fā)現(xiàn)，隨著水齡的增加，3種致病菌數(shù)量僅在垂直分布上發(fā)生變化，且隨著水中其他動(dòng)植物的死亡，逐漸集中于壓載艙底部，最終呈現(xiàn)出隨水深的增加而逐漸增加，但在總數(shù)上并沒有像水生動(dòng)物和藻類一樣呈現(xiàn)出減少的趨勢(shì)。

b) D2c) L1

d) L2e) L3

f) T1g) T2

圖2 底層致病菌隨水齡的變化

3 結(jié)束語

該研究通過對(duì)3種主要致病菌在壓載水中的垂直分布以及其受水齡的影響情況得出：

1) 水齡>10 d時(shí)，在封閉陰暗的壓載水環(huán)境中，時(shí)間因素對(duì)3類致病菌總數(shù)的影響不明顯。致病菌的數(shù)量并未像水生動(dòng)植物一樣隨著時(shí)間的增加而呈現(xiàn)出減少的趨勢(shì)，而是在總數(shù)上處于穩(wěn)定的狀態(tài)。

2) 壓載水中3種致病菌的分布具有鮮明的特點(diǎn)，即隨壓載水深度的增加菌落數(shù)量與檢出率逐漸增加，且隨時(shí)間推移此態(tài)勢(shì)明顯加強(qiáng)，其間若發(fā)生壓載水置換行為或水齡<10 d時(shí)則這一勢(shì)態(tài)不明顯。

3) 根據(jù)上述研究結(jié)果，在對(duì)水齡較長的壓載水進(jìn)行處理時(shí)，僅需對(duì)壓載艙底層壓載水和沉積物進(jìn)行處理，便能在大大減少壓載水的處理量的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)壓載水的有效管理。此外，在評(píng)估壓載水排放是否達(dá)標(biāo)時(shí)應(yīng)重點(diǎn)監(jiān)測艙底的壓載水和沉積物。

目前對(duì)壓載水致病菌的研究依然有待深入，未來研究方向可以是對(duì)以往壓載艙殘留物中的致病菌進(jìn)行跟蹤調(diào)查以探究其在壓載水轉(zhuǎn)運(yùn)過程中對(duì)新載入壓載水的影響情況，或是對(duì)壓載艙沉積物中各種致病菌來源與變化情況或是對(duì)溫度、鹽度、pH及溶解氧等多種環(huán)境因子影響下3種致病菌的動(dòng)態(tài)變化情況進(jìn)行深入探究，以實(shí)現(xiàn)對(duì)壓載水中致病菌的科學(xué)管理。