王彥玲 黃琳燕

摘 要：蛋白質的醋酸纖維薄膜電泳分離速度快，對樣品吸附少，分離條帶清晰，靈敏度高，樣品用量少，是本科實驗教學中的基礎性實驗項目，然而在實踐過程中發(fā)現(xiàn)諸多問題，本文從電泳液、漂洗液及實驗各環(huán)節(jié)細節(jié)方面進行優(yōu)化改進，取得了良好的實驗效果。

關鍵詞：醋酸纖維薄膜;硼酸緩沖液;蛋白質電泳;實驗教學

中圖分類號：Q5-33 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）22-0201-02

蛋白質的醋酸纖維薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜為介質進行的蛋白質電泳分離實驗，由于其分離速度快，對樣品吸附少，染色后背景能完全脫色，靈敏度高，樣品用量少，操作簡單等特點，是臨床醫(yī)學檢驗中常用的蛋白質檢測手段[1]，也是本科實驗教學中開展的基礎性實驗項目[2]。在過去的實驗教學中，通常以PH8.4的巴比妥緩沖液為電泳液，以人血清為樣本進行電泳分離，電泳后以氨基黑染液進行染色固定，漂洗至背景無色后吸干水分觀察結果。人血清電泳后在薄膜上可形成5條清晰的區(qū)帶，從正極到負極依次為白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白[3]。然而，在多年的實踐過程中發(fā)現(xiàn)，巴比妥緩沖液在配制時較難溶解，常需加熱1-2小時方可溶解完全，且在電泳過程中容易有溶質析出，電泳效果不理想。同時配制緩沖液所需的巴比妥和巴比妥鈉均為麻醉鎮(zhèn)靜藥物，近年來國家對毒麻藥品的管制日趨嚴格，在試劑采購和學生實驗的安全性方面有諸多限制[4]。另外，在染色液和漂洗液的配方中含有大量甲醇，甲醇有毒且易揮發(fā)，存在較大安全隱患。在實驗過程中，由于學生對細節(jié)把握不好，常出現(xiàn)學生正反面錯點、錯放，點樣時條帶過干或過濕，點樣區(qū)接觸濾紙橋，樣品太多、太少等問題，導致電泳效果不理想。針對以上問題，本文從電泳液、漂洗液及實驗各環(huán)節(jié)細節(jié)方面進行優(yōu)化改進，取得了良好的實驗效果。

1 儀器、試劑及材料

1.1 儀器

DYY-8C型電泳儀（北京六一儀器廠），DYCP-38A型臥式水平電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.2 試劑

0.06mol/L PH 8.4的巴比妥緩沖液：稱取巴比妥鈉10.3g、巴比妥1.84g，加蒸餾水溶解，定容至1000ml。

0.2mol/L PH 8.4的硼酸鹽緩沖液：稱取硼砂8.58g，硼酸6.8g，加蒸餾水溶解定容至1000ml。

染色液：氨基黑10B 0.5g，溶于冰醋酸10ml、無水乙醇50ml、水40ml的混合液中，于試劑瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

漂洗液：無水乙醇45ml，蒸餾水50ml，冰醋酸5ml，混勻后于試劑瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 材料

健康人血清，2cmx8cm醋酸纖維薄膜（路橋四甲生化塑料廠），自制點樣器，鑷子等。

2 實驗過程

制作濾紙橋，注入電泳液→浸泡薄膜→點樣→電泳→染色→漂洗→觀察結果，拍照。

3 實驗方法的優(yōu)化改進

3.1 實驗前的準備

電泳槽兩側液面要保持在同一水平線;濾紙橋制作時要卡緊，防止突出太多沾到條帶上的樣品，影響實驗效果。濾紙橋要濕透，而中間的平臺上要保持干燥，不要存有液體，防止電泳時薄膜中間沾到電泳液，使薄膜濕度不均，影響實驗效果。薄膜拿到后先分辨出無光澤面，在無光澤面右上角用鉛筆標記學號后兩位，在后續(xù)點樣和觀察結果時始終保持標記在右上角，便于分辨正反面和點樣端。注意不要用記號筆做標記，否則在后續(xù)染色和漂洗過程中標記會脫色消失。

3.2 點樣

點樣前將薄膜從緩沖液中撈出，用吸水紙吸去多余的水分，注意不要過分吸干，要保持薄膜濕潤狀態(tài)（無白點，白斑）;也不要過濕，否則樣品容易彌散，條帶不成型。實驗人數(shù)較多時，不要將薄膜一次全部撈出，應按次序輪流操作，輪到自己時，再將自己的薄膜撈出。點樣時在平整光滑的平面上點樣，無光澤面朝上，即保持所做標記在右上角，樣品不要沾太多或太少，沾取樣品后，在培養(yǎng)品邊緣靠去呈液滴狀多余的血清再點樣，使得點樣后呈均一的一條直線;點樣線應平行于薄膜的短邊，并與薄膜的短邊邊緣留有約1.5cm的距離，防止放置薄膜時樣品碰到濾紙橋;點樣前可先用鉛筆在薄膜準備點樣位置劃一條直線，引導點樣;學生可先在濾紙上練習點樣，熟悉點樣器操作和樣品量的控制。

3.3 電泳

點樣完成后，及時的將薄膜放置在濾紙橋上，注意點樣面朝下，點樣端在負極，另一端在正極。放置時，應使薄膜邊緣先與濕潤的濾紙接觸，然后緩緩放置，防止薄膜與濾紙產生氣泡。還應提醒學生，注意放置時防止樣品沾到濾紙橋。實驗課時學生人數(shù)較多，點樣花費時間長，應要求每個學生放置薄膜后及時將電泳儀蓋上蓋子，防止先點樣的條帶在空氣中中間部分干燥，薄膜濕潤度不均，影響實驗效果。全部點樣完成后，蓋上蓋子，使薄膜平衡5-10分鐘后再開始電泳。電泳時，巴比妥緩沖液采用160v，40min電泳，硼酸鹽緩沖液采用160v，20min電泳。

3.4 染色、漂洗

電泳完成后，將薄膜轉移至盛有染色液的培養(yǎng)皿中，注意，薄膜要一條一條的放入，保證兩條薄膜間沒有無染液的重疊區(qū)。染色30s即可進行漂洗。漂洗至背景無色后，擦干表面水分，保持標記在右上角，觀察并拍照。

4 實驗結果

如圖1所示，以巴比妥緩沖液為電泳液得到的薄膜僅可看見2-3條清晰條帶（圖1a），改為硼酸鹽緩沖液電泳后，可得到清晰的5條條帶（圖1b，f，g）。條件優(yōu)化前，經常發(fā)生點樣過多，有液滴，條帶形狀不好，不容易辨認（圖1c）;樣品點在光面，薄膜正負極放錯，導致無條帶（圖1d）;點樣時薄膜沒有擦干多余水分，放置薄膜時樣品碰到濾紙橋或者沾到濾紙橋平面上灑落的電泳液導致樣品彌散，條帶模糊（圖1e），條件優(yōu)化后，得到清晰的條帶（圖1b，f，g）。

5 討論

傳統(tǒng)的醋酸纖維薄膜電泳通常以0.06mol/L的巴比妥緩沖液進行電泳，染色液以甲醇、醋酸和水的混合物為溶劑，漂洗液中也含有大量甲醇。然而巴比妥類屬于管制藥品，學生實驗也存在一定的安全隱患，而甲醇有毒，且易揮發(fā)，學生實驗課人數(shù)多，接觸時間長，易損害學生健康。本文探索了以硼酸鹽緩沖液進行電泳，以乙醇替代染色液和漂洗液中的甲醇的實驗模式，實驗結果證明，和傳統(tǒng)的巴比妥緩沖液相比，以硼酸鹽緩沖液進行電泳條帶分離更清晰，更易辨認，血清蛋白的5條皆可分離，且實驗所需時間更短，僅需電泳20min即可得到良好的分離效果;改良后的染色液和漂洗液使用后，條帶染色清晰，背景脫色完全。通過實驗各環(huán)節(jié)的優(yōu)化，實驗效果得到了很大改善，可以穩(wěn)定的分離出清晰的條帶，實驗的安全性也得到了提高，可供廣大開展醋酸纖維薄膜電泳實驗教學的機構借鑒。

參考文獻

[1] 張龍翔，等編.生化實驗方法和技術[M].北京：高等教育出版社，1997.

[2] 王慶松，文朝陽，李寶紅，等.醫(yī)學生物學實驗第二課堂教學的探索與實踐[J].繼續(xù)醫(yī)學教育，2014，28（11）：91-93.

[3] 童紅梅，靳彩虹，李多福，等.醋酸纖維薄膜電泳法分離人外周血清蛋白實驗技巧探討[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2012，30（8）：105-106.

[4] 王慶松，馬惠蘋，劉華.硼酸緩沖液用于醋酸纖維薄膜電泳的分離效果以及在實驗教學中的應用[J].繼續(xù)醫(yī)學教育，2017，31（8）：65-66.