(江山市畜牧獸醫(yī)局，324100)

非洲豬瘟(ASF)是由非洲豬瘟病毒(ASFV)引起的家豬、野豬的一種急性、熱性、高度接觸性動(dòng)物傳染病，死亡率高達(dá)100%。LAMP法因其高效靈敏、價(jià)格低廉，且不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，在規(guī)模豬場(chǎng)的非洲豬瘟排查中具有優(yōu)勢(shì)。

1 LAMP方法的特點(diǎn)

LAMP方法全稱(chēng)Loop-mediated isothermal amplification,即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法，是2000年日本學(xué)者Notomi等報(bào)導(dǎo)的一種新的恒溫核酸擴(kuò)增方法。特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在60～65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增，能夠在15～60 min即可實(shí)現(xiàn)109-1010的核酸擴(kuò)增，具有特異性高、靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。此外，因只需在60～65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增，需要儀器簡(jiǎn)單成本低，且反應(yīng)產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀只需肉眼就能觀(guān)察到，因此還有鑒定方便的優(yōu)點(diǎn)。

2 LAMP方法與其它檢測(cè)方法的對(duì)比

目前非洲豬瘟的主要檢測(cè)技術(shù)有2大類(lèi)，即基于抗原、抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法及核酸檢測(cè)方法。免疫學(xué)方法檢測(cè)因抗體只有在病毒入侵至一定時(shí)期才會(huì)出現(xiàn)，因此在對(duì)非洲豬瘟早期排查時(shí)存在局限性。而傳統(tǒng)的針對(duì)核酸的監(jiān)測(cè)方法,如PCR法相比之LAMP法則存在成本較高的問(wèn)題，特別是實(shí)時(shí)熒光PCR，耗費(fèi)高且難以擺脫實(shí)驗(yàn)室的限制，在豬場(chǎng)的自我排查時(shí)難以推廣。

3 使用LAMP方法排查時(shí)的注意事項(xiàng)

在LAMP試驗(yàn)中，最主要的缺點(diǎn)就是容易產(chǎn)生假陽(yáng)性高。這主要是因?yàn)樗臄U(kuò)增產(chǎn)物本身就是模板，且反應(yīng)是在恒溫下進(jìn)行的，所以如果在同一地方進(jìn)行多次試驗(yàn)，前面反應(yīng)產(chǎn)物所形成的氣溶膠很容易污染后續(xù)試驗(yàn)，從而造成假陽(yáng)性。

該問(wèn)題也并非不能克制，只要操作人員在實(shí)際操作中注意一些細(xì)節(jié)，就能有效避免污染的存在。使用LAMP方法排查時(shí)應(yīng)遵循以下幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：

一是操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，吹打混勻溶液時(shí)不要有氣泡產(chǎn)生，避免EP管劇烈震蕩。

二是除酶制劑及不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。

三是各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存。

四是實(shí)驗(yàn)室要注意通風(fēng)，最好選擇超凈工作臺(tái)和生物安全柜。實(shí)驗(yàn)室要定期進(jìn)行清潔及紫外照射，消除潛在污染。