陳祥和 余慧琳 徐帥 楊康 張憲亮 趙仁清 孫開宏

1. 揚(yáng)州大學(xué)體育學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127 2. 淮陰師范學(xué)院體育學(xué)院，江蘇 淮安 223001 3. 山東大學(xué)體育學(xué)院，山東 濟(jì)南 250000 4. 揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)體育學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)作為因能量代謝紊亂導(dǎo)致的繼發(fā)性疾病，胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和高血糖將引起組織器官結(jié)構(gòu)及功能受損，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松等并發(fā)癥發(fā)生[1]。骨細(xì)胞分泌的非羧基化骨鈣素(uncarboxylated osteocalcin，ucOCN)可調(diào)控葡萄糖及脂肪轉(zhuǎn)化和利用，影響能量代謝；同時(shí)能量代謝亦通過反饋環(huán)路：瘦素-下丘腦-交感神經(jīng)調(diào)節(jié)骨形成，影響骨代謝[2]。AMP依賴蛋白激酶(AMP-dependent protein kinase，AMPK)是能量代謝關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，其α亞基N-末端含有保守絲氨酸(serine，Ser)/蘇氨酸(threonine，Thr)激酶區(qū)，該區(qū)域保守Thr-172位點(diǎn)被磷酸化后激活下游相應(yīng)信號(hào)途徑來調(diào)控骨代謝、能量代謝、心血管系統(tǒng)等。

T2DM骨代謝紊亂發(fā)生中，破骨細(xì)胞(osteoblast，OC)分化及骨吸收異常高于成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)主導(dǎo)的骨形成。而OB或OC分化及功能發(fā)揮均是高耗能(即消耗ATP)過程，ATP/AMP比值下降激活OB和OC內(nèi)AMPKα表達(dá)[3]。而敲除AMPKα后會(huì)骨代謝紊亂，但敲除β和γ亞基對骨的影響不顯著。運(yùn)動(dòng)是改善T2DM骨代謝紊亂的有效手段，可顯著促進(jìn)OB分化及骨形成并抑制OC分化及骨吸收。而不同方式運(yùn)動(dòng)因?qū)钱a(chǎn)生的力學(xué)刺激方式不同(直接作用力和間接作用力)，故對骨產(chǎn)生的作用效果存在較大差異。直接作用力促骨形成、抑制骨吸收的作用效果顯著優(yōu)于間接作用力，且可顯著上調(diào)骨中AMPK表達(dá)[4]。然而，有關(guān)不同方式運(yùn)動(dòng)通過調(diào)控AMPK介導(dǎo)T2DM OB或OC分化及功能的相關(guān)研究有待揭示。故本研究對AMPK在運(yùn)動(dòng)影響T2DM OB和/或OC分化及功能的相關(guān)研究進(jìn)行梳理，以期闡明能量代謝在T2DM骨代謝中的作用機(jī)制，為AMPK介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)改善T2DM骨代謝的分子機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 AMPK簡介

AMPK由催化亞基α及調(diào)節(jié)亞基β和γ構(gòu)成，可調(diào)控糖/脂代謝、線粒體功能、IR、細(xì)胞自噬、神經(jīng)功能等生理過程[5-6]。骨代謝中，各AMPK亞型所扮演的角色不同。研究發(fā)現(xiàn)，AMPKα1-/-小鼠松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction, BV/TV)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Tb.N)、骨面積和橫截面積等骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)顯著下降；AMPKα2-/-敲除小鼠脛骨骨量變化卻不顯著[7]。AMPKβ1-/-小鼠松質(zhì)骨BV/TV和Tb.Th顯著下降，而皮質(zhì)骨骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)變化不顯著，AMPKβ2-/-小鼠骨組織形態(tài)相關(guān)指標(biāo)變化無差異[8]。有關(guān)AMPKγ介導(dǎo)骨代謝的相關(guān)研究尚待揭示。上述研究發(fā)現(xiàn)，AMPKα1亞基介導(dǎo)T2DM骨代謝紊亂發(fā)生，其他亞基作用不顯著。

2 T2DM導(dǎo)致骨代謝紊亂發(fā)生

T2DM骨代謝紊亂發(fā)生與高血糖、IR等導(dǎo)致的OB分化及骨形成下降和OC分化及骨吸收能力異常升高密切相關(guān)。并且，該過程受關(guān)鍵分子、激素等調(diào)控。高血糖造成低血鈣、鎂導(dǎo)致甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)分泌增加，抑制核因子κ B受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)，激活核因子κB受體激活因子(nuclear factor kappa B receptor activator，RANK)，促進(jìn)OC分化及骨吸收[9]。亦可通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)/Smads信號(hào)途徑、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors, IGFs)及激活白介素-6(interleukin, IL-6)來抑制OB分化及其凋亡[10]。并且，高血糖導(dǎo)致糖基化終末產(chǎn)物(glycosylation end product, AGEs)增多，抑制OB增殖及骨形成的同時(shí)并作用于AGEs受體，產(chǎn)生IL-1等促進(jìn)OC分化，導(dǎo)致骨吸收增強(qiáng)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素分泌減少及IR導(dǎo)致OB分化和骨形成能力及OC骨吸收能力增強(qiáng)，骨重塑下降，骨中有機(jī)質(zhì)Ⅰ型膠原蛋白(type I collagen，Col1)等有機(jī)質(zhì)減少，無機(jī)質(zhì)流失，骨質(zhì)疏松發(fā)生[12]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)途徑、核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)途徑、microRNA等信號(hào)途徑激活，上調(diào)組織蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)、活化T細(xì)胞核因子c1(activated T cell nuclear factor c1，NFATc1)、激活子蛋白-1(activator protein 1，AP-1)等并下調(diào)Runx2、Col1、PHEX等表達(dá)進(jìn)而調(diào)控OC分化和骨吸收能力及OB分化和骨形成能力，抑制骨重塑，導(dǎo)致T2DM骨質(zhì)疏松[13-14]。T2DM機(jī)體內(nèi)性激素分泌減少及脂肪細(xì)胞分泌產(chǎn)生的瘦素增多，亦導(dǎo)致骨基質(zhì)和骨量減少[15]。近來發(fā)現(xiàn)，能量代謝紊亂介導(dǎo)T2DM骨質(zhì)疏松。AMPK作為調(diào)控能量代謝的關(guān)鍵酶，與沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulator 1, SIRT1)結(jié)合后調(diào)控下游哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、輔助激活因子-1α(PPARγcoactivator -1α, PGC-1α)等能量代謝調(diào)控因子，作用于OB和OC分化及功能，調(diào)控骨代謝[16]。然而，有關(guān)AMPK介導(dǎo)T2DM骨代謝紊亂的研究卻較少。

3 AMPK介導(dǎo)T2DM骨代謝紊亂作用機(jī)制

3.1 AMPK介導(dǎo)T2DM OB分化

OB是主導(dǎo)骨形成細(xì)胞，由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells, BMSCs)分化產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)/BMPs、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog等關(guān)鍵途徑可直/間接作用于Runx2、Osterix等靶基因，調(diào)控OB分化[17]。而生長分化因子-11(growth differentiation factor 11，GDF11)、Orai1、micro RNAs(如miR-764-5p、miR-338-3p、等)等關(guān)鍵分子亦起重要作用[18]。OB分化及骨形成紊亂造成骨代謝失調(diào)。T2DM大鼠BMSCs分化產(chǎn)生的OB數(shù)量和骨形成能力被抑制，使得骨形成下降[19]。在研究PPARγ抑制劑對T2DM小鼠脂肪細(xì)胞分化影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞分化增多的同時(shí)，OB數(shù)量減少且成骨能力下降[20]。對T2DM小鼠分化產(chǎn)生的OB進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色，發(fā)現(xiàn)OB數(shù)量和骨形成能力顯著下降[21]。綜上表明，T2DM骨質(zhì)疏松發(fā)生與OB數(shù)量和骨形成能力下降密切相關(guān)。自發(fā)性T2DM小鼠(KK-Ay小鼠)OB合成Col1等有機(jī)質(zhì)減少，造成鈣、磷等沉積障礙，使得BMD下降及骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)退化[12]。并且，T2DM OB自噬和凋亡增加，亦會(huì)負(fù)向調(diào)控OB分化及骨形成[22]。

T2DM抑制OB分化過程受眾多信號(hào)途徑或分子調(diào)控。AMPK磷酸化后將開啟一系列復(fù)雜信號(hào)途徑，加快ATP合成并減少ADP消耗。并且，其作為應(yīng)答代謝壓力的傳感器，當(dāng)乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)等底物被抑制后，可抑制脂肪酸和膽固醇合成途徑(即分解ATP的能量消耗途徑)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK通過胰島素途徑調(diào)控T2DM發(fā)生，當(dāng)胰島素信號(hào)途徑被抑制(如IR)時(shí)，其可作為備用途徑參與糖脂代謝，改善IR[24]。另外，AMPK α1亞基敲除小鼠出現(xiàn)高血糖、高血脂且骨組織病理表征與T2DM小鼠表型相似。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，AMPKα1-/-小鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周后，骨組織表征與T2DM的病理特征更一致。提示，AMPKα1基因缺失是T2DM發(fā)病及骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主因。

T2DM骨質(zhì)疏松癥與OB分化減少及骨形成能力下降息息相關(guān)[25]，但其分子調(diào)控機(jī)制尚不清晰。AMPK是一多底物Ser/Thr蛋白激酶，近來證實(shí)，其在T2DM發(fā)病過程中扮演關(guān)鍵調(diào)控作用。將其敲除后，eNOS-NO途徑下調(diào)BMP-2及下游Runx2表達(dá)，抑制T2DM大鼠OB分化及骨形成能力[26]。Meier等[27]在綜述T2DM對骨影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)T2DM骨質(zhì)疏松甚至骨折發(fā)生與AMPK/USF-1/SHP途徑被抑制后下調(diào)Runx2、Dlx5和Osterix等表達(dá)，進(jìn)而抑制OB分化及骨形成密切相關(guān)。當(dāng)利用DN-AMPK(AMPK抑制劑)抑制MC3T3-E1中AMPK磷酸化后，通過孤兒核受體SHP調(diào)控Runx2反式激活，降低OB骨形成及標(biāo)志基因：ALP、骨鈣素(osteocalcin，OCN)等表達(dá)[28]。T2DM大鼠骨中AMPK失活后，骨形成特異性基因：ALP、OCN、Runx2/Cbfa1 等表達(dá)下調(diào)會(huì)抑制OB分化；體外研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)MPK可上調(diào)骨形成基因ALP、OCN、Runx2/Cbfa1 等表達(dá)，促進(jìn)OB分化及活性[29]。

3.2 AMPK介導(dǎo)T2DM OC分化

作為主導(dǎo)骨吸收的OC，其分化及骨吸收能力增強(qiáng)是T2DM骨質(zhì)疏松發(fā)生另一主因，但有關(guān)T2DM促進(jìn)OC分化的相關(guān)研究尚存爭議。Kitamura等[30]研究發(fā)現(xiàn)，T2DM金魚骨量下降與骨基質(zhì)中膠原纖維的非酶糖基化下降相關(guān)，而其TRAP活性變化不顯著。但有研究卻發(fā)現(xiàn)，T2DM小鼠礦化染色呈骨質(zhì)疏松表征，且骨中OC活性(即TRAP活性)增強(qiáng)[31]。脛骨硬組織切片TRAP染色后多核OC數(shù)量增多，其松、皮質(zhì)骨：BV/TV、Tb.N、Tb.Th等指標(biāo)顯著下降[32]。這與T2DM小鼠異位骨化障礙導(dǎo)致的OC數(shù)量增多及骨吸收功能增強(qiáng)密切相關(guān)[33]。上述研究結(jié)果差異，可能與研究所用動(dòng)物模型及所檢測組織的形成機(jī)制及組分存在較大差異有關(guān)。但后續(xù)研究證實(shí)，T2DM OC分化增加導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生。

AMPK是介導(dǎo)T2DM骨質(zhì)疏松發(fā)生的能量代謝調(diào)節(jié)器，但有關(guān)其調(diào)控OC分化及骨吸收的研究較少。OC分化及其骨吸收是高耗能過程，AMPK ser172位點(diǎn)磷酸化后抑制去卵巢小鼠OC分化、融核[34]。并且，AMPK作為RANKL負(fù)調(diào)節(jié)劑，激活后抑制其表達(dá)，進(jìn)而激活RANK及下游C-fos-NFATc1途徑，上調(diào)關(guān)鍵靶基因Oscar、CTSK、Atp6v0d2等表達(dá)促進(jìn)OC分化及其骨吸收能力，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生。T2DM抑制骨中AMPK表達(dá)，并且AMPKα1-/-小鼠表型與T2DM小鼠表型高度一致，說明其α1亞基敲除是T2DM發(fā)病的關(guān)鍵因素。KK/UpjAy/J (KKAy) 小鼠分化產(chǎn)生OC及多核OC數(shù)量增多，TRAP活性增強(qiáng)[35]。表明，T2DM骨代謝紊亂發(fā)生與OC分化增多且骨吸收增強(qiáng)有關(guān)。因此，AMPK調(diào)控T2DM促OC分化及骨吸收能力，其分子機(jī)制與RANKL誘導(dǎo)的C-fos-NFATc1途徑有關(guān)。

4 AMPK在運(yùn)動(dòng)改善T2DM骨代謝紊亂中的作用機(jī)制

運(yùn)動(dòng)是改善骨代謝的重要手段，不同運(yùn)動(dòng)對骨產(chǎn)生的力學(xué)刺激在促OB分化和骨形成及抑制OC分化和骨吸收的作用效果不同(直接作用力優(yōu)于間接作用力)[36]。T2DM抑制OB分化及骨形成，但有關(guān)運(yùn)動(dòng)影響此過程的相關(guān)研究較少。人體研究中，T2DM患者肥胖導(dǎo)致的體重增加雖對骨產(chǎn)生力學(xué)刺激，但OB凋亡增加、骨形成能力下降，松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)退化[37]。而動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，下坡跑產(chǎn)生的直接力學(xué)刺激可通過激活T2DM小鼠骨中TGF-β/BMPs途徑，使得BMSCs分化產(chǎn)生的OB數(shù)量增多、骨形成能力增強(qiáng)[38]。體外研究中，流體剪切力促進(jìn)T2DM小鼠體外培養(yǎng)的OB骨形成能力[39]。分析以上結(jié)果，體重對機(jī)體產(chǎn)生的直接力學(xué)刺激強(qiáng)度較小，而下坡跑和流體剪切力對T2DM骨或OB產(chǎn)生的直接力學(xué)刺激較大(包含體重對骨的力學(xué)刺激)，促OB分化及骨形成能力作用更大。運(yùn)動(dòng)調(diào)控T2DM OB分化及骨形成的分子機(jī)制尚不完善，僅證實(shí)了TGF-β/BMPs途徑。AMPKα1調(diào)控T2DM發(fā)病，敲除該基因后小鼠表型與T2DM小鼠表型高度一致。并且，下調(diào)AMPK表達(dá)抑制T2DM的OB分化及骨形成[40]。AMPK表達(dá)下調(diào)，通過eNOS-NO途徑抑制BMP-2及下游Runx2，抑制T2DM大鼠OB分化及骨形成能力[26]。體外研究亦證實(shí)，激活A(yù)MPK后上調(diào)骨形成標(biāo)志基因ALP、OC、Runx2/Cbfa1 等，促進(jìn)OB分化及其活性[41]。既然運(yùn)動(dòng)可顯著改善骨中AMPK表達(dá)及T2DM的OB分化和骨形成，并且AMPK介導(dǎo)T2DM抑制OB分化及骨形成過程。那么要問，AMPK是否介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)改善T2DM OB分化及骨形成？ Kanazawa[42]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)激活T2DM小鼠骨中AMPK，并促進(jìn)OB分化及骨形成，改善骨量和骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。因目前相關(guān)研究較少，其分子機(jī)制尚不清晰。敲除AMPK后，T2DM小鼠骨中eNOS和BMP-2表達(dá)及OB分化被抑制[43]。然而，運(yùn)動(dòng)可通過激活eNOS和BMP-2改善T2DM小鼠骨質(zhì)疏松[44]。eNOS和BMP-2作為調(diào)控骨形成兩關(guān)鍵分子，eNOS可通過PI3K/AKT/ eNOS途徑調(diào)控BMSCs向OB分化；而BMP-2作為BMPs重要亞型，可通過Smad途徑調(diào)控OB分化。綜上，運(yùn)動(dòng)可通過激活A(yù)MPKα1表達(dá)，促進(jìn)T2DM OB分化及骨形成能力，改善骨形成代謝。其機(jī)制與AMPK介導(dǎo)的Wnt/β-catenin、Runx2等密切相關(guān)。并且，骨形成代謝受TGF-β/Smad、Hedgehog、Notch等眾多途徑調(diào)控，那么，運(yùn)動(dòng)是否可通過以上信號(hào)途徑來影響T2DM OB分化及骨形成？

T2DM骨質(zhì)疏松癥發(fā)生與分化產(chǎn)生的OC和多核OC數(shù)量增多，骨吸收能力增強(qiáng)，導(dǎo)致骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)退化密切相關(guān)。運(yùn)動(dòng)作為改善T2DM骨質(zhì)疏松的重要手段，其不僅可上調(diào)T2DM小鼠骨中AMPK表達(dá)并可通過調(diào)控C-fos/NFATc1、RANKL/RANK/OPG、PI3K/AKT、ERK等途徑抑制T2DM OC分化及骨吸收[44]。敲除AMPK后，C-fos/NFATc1途徑被抑制，T2DM的OC分化及骨吸收增強(qiáng)。AMPK亦可通過RANKL/RANK/OPG分子軸、PGC-1β、PI3K/AKT和ERK等進(jìn)行調(diào)控[45]。那么，既然AMPK介導(dǎo)T2DM發(fā)生，又介導(dǎo)其OC分化、融核及骨吸收。不禁要問，AMPK是否介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)抑制T2DM OC分化及骨吸收？研究發(fā)現(xiàn)，游泳可顯著提高T2DM大鼠骨骼肌AMPK表達(dá)。但是，運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)T2DM骨中AMPK表達(dá)，調(diào)控OC分化及骨吸收能力的研究較少。綜合國內(nèi)外相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)：①T2DM促進(jìn)OC分化及骨吸收；②AMPK敲除促進(jìn)T2DM OC分化及骨吸收；③運(yùn)動(dòng)(尤其是直接作用力)抑制T2DM OC分化及骨吸收。因此，運(yùn)動(dòng)抑制T2DM OC分化及骨吸收的分子機(jī)制，與AMPK活化后，抑制C-fos/NFATc1、RANKL/RANK/OPG、PI3K/AKT等信號(hào)途徑有關(guān)。

5 總結(jié)與展望

AMPK是調(diào)控能量代謝關(guān)鍵分子，亦是T2DM發(fā)生基礎(chǔ)，其激酶上的活性/調(diào)節(jié)功能域被ATP/AMP激活后，可調(diào)控OB和/或OC分化及功能發(fā)揮。通過對已有相關(guān)文獻(xiàn)分析，發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)激活A(yù)MPK后促進(jìn)T2DM OB分化及骨形成，并抑制OC分化及骨吸收，改善骨質(zhì)疏松。因目前研究較少，仍存在較多盲點(diǎn)：AMPK有7種亞型，每種亞型的作用及機(jī)制尚待深入研究；AMPK調(diào)控T2DM骨質(zhì)疏松癥的研究較多，但其分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不完善；不同方式運(yùn)動(dòng)是否均能激活T2DM骨中AMPK表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控骨代謝？哪種方式運(yùn)動(dòng)效果更佳？除eNOS-NO、Wnt/β-catenin等途徑，是否還存在其他途徑在AMPKα介導(dǎo)T2DM OB分化及骨形成的運(yùn)動(dòng)適應(yīng)中發(fā)揮作用？運(yùn)動(dòng)激活A(yù)MPKα后，除作用于RANKL/RANK/OPG分子軸外，是否還存在其他途徑發(fā)揮作用？目前AMPK介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)影響T2DM骨質(zhì)疏松癥的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚待描繪。等等。相信，隨著以上問題的解決將有助于我們深入了解T2DM骨質(zhì)疏松發(fā)生的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。并且還可讓我們熟知運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下，AMPK調(diào)控T2DM OB分化及骨形成及OC分化及骨吸收的具體機(jī)制或網(wǎng)絡(luò)，為以后運(yùn)動(dòng)改善T2DM骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。