劉蘭蘭 李武 孫思 張莉 張濤 呂純芳 陳忠偉 羅珍冑 陳祥生

1深圳市南山區(qū)慢性病防治院皮膚性病防治科518000；2深圳市南山區(qū)慢性病防治院檢驗(yàn)科518000；3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所 中國疾病預(yù)防控制中心 性病控制中心，南京210042

在許多國家，生殖道沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）感染的病例數(shù)已超過淋球菌感染，占性病之首。Ct可感染各年齡人群，但主要集中于15～29歲的性活躍人群［1］。Ct感染泌尿生殖道后，約50%的男性和70%（亦有研究顯示80%）的女性無癥狀，或臨床癥狀隱匿，為Ct的防控帶來很大的挑戰(zhàn)［2］。盡管很多國家開展Ct防治項(xiàng)目（涉及免費(fèi)篩查、檢測(cè)，治療、咨詢，性伴通知等），投入大量人力、物力、財(cái)力，但收效甚微，Ct發(fā)病率仍持續(xù)上升。菌株變異、致病機(jī)制及傳播動(dòng)力學(xué)等有關(guān)Ct分子流行病學(xué)方面的研究，對(duì)于Ct的防治至關(guān)重要。

一、分子流行病學(xué)

（一）病原學(xué)特征：Ct是一類嚴(yán)格胞內(nèi)寄生、菌體大小介于細(xì)菌和病毒之間、可通過細(xì)菌濾器的原核細(xì)胞型微生物。Ct基因組全長1 042 kb（是大腸桿菌基因長度的1/4），還包含一個(gè)隱匿性質(zhì)粒，基因長度7.5 kb［3］。Ct的主要外膜蛋白（MOMP）由ompA基因編碼，該基因長度1.2 kb，由4個(gè)可變區(qū)1～4和5個(gè)保守區(qū)組成?？勺儏^(qū)基因片段的長度為40～100 bp，其中可變區(qū)2是高度變異區(qū)，這些可變區(qū)穿插在保守區(qū)中間。根據(jù)可變區(qū)序列氨基酸序列的不同，可將Ct分為19種血清型（A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、Ga、H、I、Ia、J和K型，以及L1、L2、L2a和L3）［4］。

（二）分子流行病學(xué)技術(shù)：宏觀橫斷面流行病學(xué)研究可分析Ct在時(shí)間、地區(qū)及人群中的分布，若了解Ct血清型別的分布、識(shí)別基因序列的變異與進(jìn)化、傳播動(dòng)力學(xué)、鑒別治療失敗與再感染等的微觀信息，則需通過分子流行病學(xué)的方法進(jìn)行分析。分子流行病學(xué)方法主要包括限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）和ompA基因測(cè)序分型等（表1）。

1.RFLP：是基于ompA基因的PCR-RFLP分析而對(duì)Ct菌株進(jìn)行分型的一種方法，其原理是首先用特定的引物擴(kuò)增ompA基因，然后用限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR擴(kuò)增的ompA基因產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切的順序?yàn)椋合扔脙?nèi)切酶AluⅠ進(jìn)行酶切，然后用其他內(nèi)切酶（HinfⅠ、EcoRⅠ、DdeⅠ、CfoⅠ或BstUⅠ）進(jìn)行酶切，根據(jù)酶切片段的長度不同，通過凝膠電泳對(duì)Ct菌株進(jìn)行分型。研究發(fā)現(xiàn)，該方法與血型分型結(jié)果的一致率達(dá)95.0%［5］。PCR-RFLP既不需要對(duì)Ct菌株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，也不需要對(duì)Ct的單克隆抗體進(jìn)行純化，且操作簡單，耗時(shí)短，因而得到較廣泛的應(yīng)用。然而，RFLP也有局限性，若多種型別同時(shí)感染或重組菌株感染，酶切之后，則會(huì)產(chǎn)生非典型性、模糊不清的片段。對(duì)于這些非典型性條帶，需反復(fù)酶切鑒定，工作繁重且耗時(shí)。此外，RFLP是單位點(diǎn)分型方法，分辨率低，加之ompA基因具有一定程度的變異，因此，RFLP不能鑒別單個(gè)核酸的變化。

2.ompA基因測(cè)序分型：與其他分型方法相比，ompA基因測(cè)序分型具有較高的分辨率，可發(fā)現(xiàn)Ct序列中微小的變異，是目前研究Ct分子流行病學(xué)的主要方法。隨著技術(shù)的改進(jìn)，在ompA基因測(cè)序分型的技術(shù)上，衍生出兩種方法，包括多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）和多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析（multilocus variable number tandem repeats analysis，MLVA），這兩種方法可識(shí)別種群的遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)物種的多樣性及評(píng)估基因型別與疾病之間的關(guān)系。

MLST是基于對(duì)5個(gè)Ct管家基因（hctB、CT058、CT144、CT172、pbpB）進(jìn)行巢式擴(kuò)增，然后測(cè)序分析，從而對(duì)菌株的等位基因進(jìn)行多樣性比較分析。研究發(fā)現(xiàn)，與ompA基因分型相比，MLST具有較高的鑒別能力。Klint等［6］用MLST和ompA基因分型方法對(duì)47個(gè)臨床分離的菌株進(jìn)行分型，結(jié)果顯示，MLST可發(fā)現(xiàn)32種變異型菌株，ompA基因分型僅發(fā)現(xiàn)12種變異型菌株。MLVA是基于分析Ct基因組ompA和不同位點(diǎn)可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列的特征，然后采用聚類分析對(duì)Ct進(jìn)行分型。MLVA分型能更準(zhǔn)確揭示Ct聚集特征、菌株起源與變異等流行病學(xué)信息。同樣，與MLST類似，MLVA的分辨率亦高于ompA分型法。

3.雜交法：雖然MLST及MLVA的分辨率較高，但不能區(qū)分混合感染菌株的型別，而雜交法可區(qū)分混合感染。目前雜交法有3種，反向線性雜交技術(shù)（reverse line blot hybridization）、反向點(diǎn)雜交技術(shù)（reverse dot blot hybridization）和微球懸浮芯片雜交技術(shù)（microsphere suspension array hybridization）。反向線性雜交技術(shù)是將擴(kuò)增的基因產(chǎn)物與已標(biāo)記探針的尼龍膜雜交，再與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，會(huì)在膜上出現(xiàn)斑點(diǎn)，通過對(duì)雜交斑點(diǎn)分析，可進(jìn)行分型，并可鑒別混合感染，其主要缺點(diǎn)是耗時(shí)（1.5 d）。有學(xué)者用反向線性雜交技術(shù)對(duì)Ct進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)Ct混合感染率為8%～25%［7］。反向點(diǎn)雜交技術(shù)與反向線性雜交技術(shù)類似，相較于后者，其操作簡單且耗時(shí)短，不需要特殊機(jī)器，結(jié)果肉眼可讀，還可根據(jù)待測(cè)標(biāo)本的數(shù)量準(zhǔn)備雜交膜的數(shù)量，且標(biāo)本的排放順序比較靈活。微球懸浮芯片雜交技術(shù)也是基于雜交技術(shù)，但與反向點(diǎn)雜交技術(shù)和反向線性雜交技術(shù)相比，不需將探針或DNA產(chǎn)物固定在膜上。該方法操作簡單，耗時(shí)短且結(jié)果易理解，對(duì)多重感染具有較高的鑒別能力。雜交技術(shù)的主要缺點(diǎn)是分辨率低于ompA分型，且依賴于固定的探針，對(duì)于變異的菌株很難鑒別。

4.DNA芯片技術(shù)：也稱為DNA微陣列，是一種多位點(diǎn)分型DNA（multilocus typing DNA）芯片技術(shù)，多位點(diǎn)的選取與MLST的靶區(qū)域相同。與MLST相比，多位點(diǎn)分型DNA避免過度測(cè)序，快速（96個(gè)標(biāo)本可同時(shí)檢測(cè)）且靈敏度高。研究顯示，多位點(diǎn)分型DNA的分辨率是ompA測(cè)序的2.4倍，且特異度高達(dá)100.0%［8］。多位點(diǎn)分型DNA結(jié)果的分析可在1 d內(nèi)完成，耗時(shí)遠(yuǎn)低于MLST（3～4 d），且數(shù)據(jù)分析及分型可直接在多位點(diǎn)分型系統(tǒng)中分析。此外，多位點(diǎn)分型DNA設(shè)備及耗材的費(fèi)用較DNA測(cè)序低。

5.全基因組測(cè)序：由于不同Ct菌株型別之間會(huì)發(fā)生大量重組，采用ompA測(cè)序研究這種重組菌株，其結(jié)果并不可靠。全基因組測(cè)序可深入了解Ct的進(jìn)化、變異、多樣性及流行狀況。全基因組測(cè)序需依靠細(xì)胞培養(yǎng)，以提供足量Ct DNA，而細(xì)胞培養(yǎng)的陽性率較低且培養(yǎng)周期長，使其過程變得繁瑣，限制了在臨床的廣泛應(yīng)用。近年來，隨著免細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的引入，可直接從臨床標(biāo)本中提取足量DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序。其中一種免細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是將MOMP結(jié)合抗體附著于磁珠，以從臨床標(biāo)本中分離富集Ct感染的細(xì)胞［8］。對(duì)于一些商業(yè)標(biāo)本采集管，由于管中的裂解緩沖液會(huì)破壞MOMP的結(jié)構(gòu)，因此無法使用該方法。盡管全基因組測(cè)序可更全面、更深入的了解Ct，但費(fèi)用昂貴，且需要技術(shù)精湛的專業(yè)人員及特殊設(shè)備。

二、分子流行病學(xué)技術(shù)的應(yīng)用

1.開展分子流行病學(xué)調(diào)查與檢測(cè)：全球Ct主要的流行型別為E（30.0%）和F（12.9%），是比較保守的型別，而高度變異的型別是L2和G［9］。Rodriguez等［10］發(fā)現(xiàn)，E型不但是主要的流行型別，而且非常穩(wěn)定，地域間的差異較小。研究表明，大部分感染者是由少數(shù)血清型引起，型別在不同人群中的分布存在一定差異。在社區(qū)、不孕不育、性病門診及學(xué)生人群中，主要流行型別均是E型，次要流行型別則多種多樣。女性性工作者的主要流行型別在不同的研究中不同，如泰國女性性工作者的主要流行型別是F，中國和韓國是E型，匈牙利則是D型。然而，男男性行為者（MSM）人群中常見的流行型別是G、D及J，且D型在無癥狀MSM的尿道和肛周陽性率較高［11］。若在一個(gè)地區(qū)發(fā)現(xiàn)了新型別，則可能是由于本地人與其他地區(qū)的人發(fā)生性行為，進(jìn)而引進(jìn)新的血清型別。

2.開展臨床分子流行病學(xué)研究：不同的Ct型別可引起不同臨床癥狀［12］。其中A、B、Ba及C型常見于熱帶和亞熱帶地區(qū)，主要引起沙眼，經(jīng)眼-眼或眼-手-眼傳播，嚴(yán)重者可影響視力甚至致盲［13］。研究發(fā)現(xiàn)，泌尿生殖道標(biāo)本中亦可檢出A型和B型Ct，說明引起沙眼的菌株與引起生殖道感染的菌株之間可能存在重組，導(dǎo)致兩組型別之間有交叉感染［14］；C～K型主要引起泌尿生殖道感染［15］；有過孕史的女性較易感染D型［16］。E型感染多無癥狀，易被感染者忽略，這也是E型是優(yōu)勢(shì)菌株的原因，但也有研究報(bào)道，E型與異位妊娠及陰道綠色分泌物有關(guān)［16-17］。此外，相較于其他型別，感染F/G型的女性較易出現(xiàn)下腹疼痛，但疼痛程度較其他型別引起的下腹疼痛輕［18］。

有報(bào)道，E型可引起新生兒結(jié)膜炎［14］；L1～L3型通過性接觸傳播，引起性病性淋巴肉芽腫（LGV）亞種［19］。LGV主要分布于MSM人群，但有研究顯示，L2感染與女性盆腔炎有關(guān)［16］。

3.鑒別持續(xù)感染、再感染與治療失?。撼掷m(xù)感染與治療失敗為Ct的防治帶來挑戰(zhàn)。研究顯示，Ct復(fù)發(fā)感染在性活躍人群中較常見。2002年，一項(xiàng)Meta分析表明，阿奇霉素1 g單劑口服和多西環(huán)素對(duì)Ct感染的治愈率分別是97%和98%［20］。另有研究顯示，1 g單劑口服阿奇霉素對(duì)生殖道沙眼衣原體的治愈率為71.6%，明顯低于前者的治愈率［21］。復(fù)發(fā)的原因究竟是治療期間的性行為導(dǎo)致的再次感染，還是治療失敗引起，仍然需通過對(duì)Ct菌株型別的分型進(jìn)行鑒定。

4.協(xié)助LGV的臨床診斷：近年來，LGV在歐洲、非洲、東南亞及北美等國家的報(bào)告病例數(shù)逐漸上升［22］。LGV具有較強(qiáng)的侵襲性，在MSM人群的肛門-直腸拭子標(biāo)本中檢出率較高，這與其組織嗜性及宿主特殊的性行為有關(guān)［8］。荷蘭學(xué)者在MSM人群中發(fā)現(xiàn)新型LGV，將其命名為L2b［23］。隨后，奧地利學(xué)者也是在MSM Ct陽性者中發(fā)現(xiàn)，MOMP的VS1、VS2及VS4區(qū)域發(fā)生變異的新型別，并將其命名為L2c、L2d及L2e［24］。肛門直腸的LGV感染癥狀常隱匿或無癥狀，易被患者忽視，且較難與其他Ct感染型別區(qū)分［8］，因此，有必要在MSM人群中開展Ct篩查，并對(duì)陽性標(biāo)本進(jìn)行分型，以鑒別感染型別及發(fā)現(xiàn)LGV新型別。

5.發(fā)現(xiàn)變異菌株：2006年，在瑞典發(fā)現(xiàn)新型變異菌株（new variantChlamydia trachomatis，nwCT）。之所以將其稱為nwCT，是由于該菌株的隱蔽性質(zhì)粒缺失了377 bp長度的基因片段。當(dāng)時(shí)核酸檢測(cè)技術(shù)的目標(biāo)引物恰好包含此缺失片段，因此漏檢了nwCT，使其迅速在人群中擴(kuò)散傳播。研究顯示，nwCT菌株是E型，且多分布于性活躍的年輕人群中［25］。nwCT在其他國家里亦有發(fā)現(xiàn)，如墨西哥、丹麥及法國等［26］。目前，盡管在我國尚未發(fā)現(xiàn)nwCT，但仍有必要用分子流行病學(xué)技術(shù)對(duì)類似的變異進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以及時(shí)采取防控措施。

三、結(jié)語

Ct發(fā)病率高、流行范圍廣、危害嚴(yán)重，引起全球公共衛(wèi)生高度關(guān)注。為降低Ct感染的疾病負(fù)擔(dān)，推廣Ct感染篩查及分子流行病學(xué)分析，采取針對(duì)性防治措施顯得愈加重要。分子流行病學(xué)方法可闡明Ct的臨床癥狀譜，發(fā)現(xiàn)變異菌株，識(shí)別優(yōu)勢(shì)菌株，評(píng)估傳播動(dòng)力學(xué)，探究菌株型別在不同人群間的分布，鑒別持續(xù)感染與新發(fā)感染等。這些分子流行病學(xué)信息可用于Ct篩查及優(yōu)化臨床治療方案等，進(jìn)而為Ct的防治提供分子生物學(xué)方面的依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突