胡 靜 李章華

1.武漢體育學院研究生院，湖北武漢 430079；2.武漢大學同仁醫(yī)院（武漢市第三醫(yī)院）骨科，湖北武漢 430074

閉合性不完全肌腱損傷在運動和生活中都十分常見，因解剖結構特異和無法自我腱性修復（只能瘢痕愈合）而留有后遺癥，給患者及其家庭帶來壓力[1]。近年來，隨著組織工程和基因工程的發(fā)展，給肌腱修復帶來了希望[2]。干細胞是具有自我復制功能的細胞，一定條件下可分化為多種功能細胞，目前，用于肌腱修復較成熟的有：骨髓間充質干細胞（BMSCs）、肌腱干細胞（TDSCs）和胚胎干細胞（ESCs）[3]。BMSCs 從骨髓中分離出來，具有自我增殖和多向分化能力，特定條件下可向肌腱、骨、軟骨等組織分化，是肌腱組織修復的重要種子細胞來源[4]。TDSCs 與肌腱細胞類似，經TDSCs 修復的肌腱很大程度上滿足了肌腱的力學要求，是很多高水平運動員的首選[5]。ESCs 是分化肌腱組織的原始細胞，其“再生記憶功能”能夠在植入的個體環(huán)境中增殖、分化，為具有完全生理結構和正常功能的肌腱組織[6]。

生長因子是通過與高親和的特異細胞膜受體結合，調控細胞生長周期的多肽類物質。其作用時幾乎都存在時間、劑量依賴和生物活性衰退等問題，通過基因轉染技術將生長因子轉染到組織或細胞，能增強表達特定蛋白，達到緩慢持續(xù)釋放的效果[7]。常見肌腱愈合的生長因子包括血管內皮生長因子（VEGF）、骨形成蛋白和成纖維細胞生長因子等，被廣泛用于肌腱損傷的基因治療[8-9]。目前，應用干細胞和基因技術治療多種疾病，但專題報道促進閉合性不完全肌腱損傷修復的文獻較少。本文綜合近年臨床和實驗研究，為干細胞和基因技術促進閉合性不完全肌腱損傷修復做一綜述。

1 肌腱損傷概述

1.1 肌腱的解剖結構及損傷后愈合過程

肌腱由分布散亂的梭形腱和縱行排列的膠原纖維構成。膠原纖維呈螺旋形、線形和交叉走形，由纖維細胞基質分隔成束，其腱鞘被覆于淺層，同時融合了肌腱腱系膜和血管系膜，在腱系膜中有動脈[10]。肌腱來自血管的營養(yǎng)較少，自身的修復愈合能力十分有限，僅通過瘢痕形成來愈合，愈合后容易出現瘢痕及鈣化等并發(fā)癥[11]。肌腱愈合大體概括為3 個階段：炎性反應期、增殖修復期和重塑期，這3 個階段互有重疊。在第一階段，中性粒細胞等炎癥細胞伴隨紅細胞移動到受損處，傷后最初1 d 內巨噬細胞和單核細胞也同樣被動員，到損傷局部吞噬壞死組織。釋放一系列如化學趨化因子等激活血管生成和腱細胞增殖。炎癥通常只持續(xù)1 周左右，隨即是增殖修復期，此過程持續(xù)1 個月左右。損傷局部的腱細胞參與合成大量蛋白聚糖和膠原，黏多糖和水分聚集較多后開始肌腱的重塑，此過程可分為強化期和成熟期[12]。

1.2 運動員肌腱損傷特點

從外觀來看，肌腱損傷分閉合性損傷和開放性損傷；從組織連續(xù)性來看，分完全斷裂和不完全斷裂損傷；還有夾雜在一起的混合性損傷。不同類型，治療方法不同[13]。專業(yè)運動員多因其專項動作的反復練習形成肌腱勞損和部分斷裂損傷，如田徑運動員以快速跑、跳類訓練居多，爆發(fā)性運動導致髕腱重復應力增加，損傷概率大。維多利亞體育評估研究所對近幾年的髕骨肌腱病調查發(fā)現，除了病理因素外，因運動相關工作造成肌腱病占69%[14]；速度、對抗型運動員要求快速的移動能力和強勁的爆發(fā)力，肌腱負荷的強度、方向和時間快速改變，肌腱損傷的概率會大大增加，如羽毛球運動員跟腱部分斷裂傷[15]。業(yè)余健身愛好者大多集中在周末或節(jié)假日鍛煉，因缺乏平時訓練和對運動強度不敏感，極易出現肌腱牽拉傷，Xu 等[16]在兔模型上證實了這個現象。

1.3 肌腱損傷治療現狀

閉合性不完全肌腱損傷臨床上常出現疼痛、滲出、紅腫和功能障礙等癥狀，在病理學上最直接的表現就是肌腱炎和腱鞘炎[17]。目前，國內外臨床治療肌腱損傷的方法有口服非甾體類消炎止痛藥、應用傳統(tǒng)醫(yī)學的中藥熏洗和針灸理療、現代聲光電康復治療等[18]。運動過程中急性肌腱損傷大多需要制動，石膏或者繃帶固定只能阻止肌腱二次損傷，并不能使肌腱自然愈合，如果恢復不好常常有攣縮或異位鈣化等后遺癥。慢性勞損和肌腱病常采取休息、口服非甾體類消炎藥和物理治療，同樣只能緩解部分癥狀，不能促進肌腱的自然愈合[19]，其反復疼痛嚴重影響運動員的訓練和比賽成績，中國飛人劉翔就是因肌腱病最終影響了他的成績和運動壽命。鑒于此，一是專業(yè)運動員及廣大運動愛好者要高度重視此??；二是急需找到肌腱損傷更好的新型療法。

2 干細胞促進肌腱愈合的研究進展

2.1 骨髓間充質干細胞

BMSCs 是從骨髓中分離得到的非造血基質干細胞，具有多向分化潛能，能夠分化為成骨細胞、肌腱細胞等。BMSCs 容易分離和體外培養(yǎng)，幾乎無免疫原性，易于外源基因轉染和表達[4]。外源目的基因通過病毒載體整合至BMSCs 基因組中更容易自我更新并分化為特定肌腱組織細胞[7]。因取材簡便、來源廣泛等優(yōu)點，BMSCs 已成為組織工程領域中多種組織再生重要的種子細胞來源[20]。近年來，干細胞治療成為臨床和科研的一個新熱點。BMSCs 已成熟應用在骨和軟骨的修復，臨床試驗中也可發(fā)現這種新的治療方法，但是用于肌腱的修復及再生，BMSCs 的研究才走出第一步。Wang 等[21]研究揭示，VEGF 轉染64 只雞的128 個指伸肌腱，組織轉染效率達到100%，并在轉染后2、4、6、8 周檢測肌腱愈合相關指標，結果證實轉染的基因可在損傷部位維持較長時間表達，并且可以顯著提高肌腱愈合，不會加重肌腱愈合后的黏連。該研究證實BMSCs 可作為修復閉合性不完全肌腱損傷的種子細胞。BMSCs 具有克隆形成、自我增殖和多向分化的能力，在特定條件下可向肌腱、骨、軟骨、脂肪等分化[4]。因具有這些特性，BMSCs 被廣泛應用于基礎研究和臨床治療[22]。近年來，BMSCs 的應用被引入運動醫(yī)學領域，用于修復運動過程中產生的急性或慢性不完全肌腱損傷。Bi 等[23]用手術方法造成大鼠髕腱不完全斷裂模型，然后將BMSCs 和VEGF 轉染后的BMSCs 分別注入髕腱缺損處，同時以普通生物材料修補和完全空白為對照組。術后第4、8、12 周取材進行檢測，比較各組之間肌腱修復標志物的表達。經組織形態(tài)學和生物力學綜合分析，VEGF 轉染后BMSCs 可縮短愈合時間、促進肌腱愈合，同時對肌腱的生物學特性也有改善作用，且效果明顯優(yōu)于普通生物材料修補和單純的BMSCs 組。Liu 等[24]用新西蘭大白兔建立跟腱損傷模型，設置BMSCs 組、自體肌腱移植組和空白對照組，8 周后取材觀察肌腱愈合情況。結果顯示，新西蘭大白兔BMSCs 組可促進跟腱損傷愈合，其療效優(yōu)于其他兩組。上述可知，BMSCs 應用于醫(yī)學領域組織的修復已有一定基礎，為后續(xù)研究奠定了基石。

2.2 肌腱干細胞

TDSCs 又叫肌腱祖細胞，2007 年Zhang 等[25]成功從人腘繩肌和小鼠髕腱提取出來。TDSCs 不僅具有自我更新、克隆形成以及多向分化的潛能，還具有干細胞特性，其與肌腱細胞相關基因和蛋白表達較高[26]。隨后研究者從人、大鼠、小鼠、馬等不同部位肌腱中也成功地將TDSCs 分離出來，用于進行肌腱修復和肌腱生理病理的研究[27]。Tian 等[28]研究提示，植入自體TDSCS 修復有窗口樣缺損的大鼠髕腱損傷進行觀察，1 個月后膠原蛋白表達水平升高，纖維束和肌腱細胞有更加規(guī)則有序的排列。接受TDSCS 治療者肌腱生物力學性能顯著高于未接受TDSCS 治療者。結論顯示，在肌腱損傷修復過程中TDSCS 起關鍵作用。相對于BMSCs 而言，TDSCs 具備更好的增殖潛能，能夠形成較多細胞集落，還能表達更多的肌腱標志相關基因，如scleraxix、tenomodulin 等；此外，TDSCs 還可以有更多肌腱細胞的胞外基質產生，如核心蛋白聚糖，Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白等。因此，TDSCs 可作為理想的細胞來修復肌腱損傷[29]，但調控TDSCs 的因素非常多，常見因素有氧分壓、細胞外基質、機械負荷和生物因素等，作用機制復雜、特性尚不完全清楚[30]，其在研究和臨床中的應用仍受到很大限制，需進一步研究。

2.3 胚胎干細胞

ESCs 是來源于胚胎的多能干細胞，具有分化為不同類型細胞和無限增殖的潛能。研究[31]提示，人和部分動物皮膚破損之后，能夠無瘢痕、功能性愈合，但是成體組織不行，這說明ESCs 可能存在某些“再生記憶功能”，能夠在植入的個體環(huán)境中增殖、誘導分化為具有完全生理結構和功能的正常組織。研究[32]發(fā)現ESCs 修復肌腱損傷的可行性并探討其相應機制，通過肌腱特殊基因和結構表達證實了肌腱組織模型中ESCs 再生的肌腱組織。Tang 等[33]用ESCs 修復肌腱比對照組有更好的結構和力學特性，而且其活性可以在肌腱損傷處保持更長時間。此外，ESCs 可以通過分泌一些肌腱特殊基質和分化因子，使肌腱內源性再生程序被進一步喚醒。前述可知，ESCs 具有某些特殊“記憶功能”，對具有完全生理結構和正常功能的肌腱組織有再生能力。在肌腱損傷處分泌的人胚胎特異基質和分化因子促進了肌腱再生，為肌腱修復提供了新方案和理論基礎。

2.4 BMSCs、TDSCs、ESCs 三者間比較

BMSCs、TDSCs、ESCs 在不同的條件下都能向肌腱分化，但具有各自的特點。BMSCs 是肌腱組織工程中應用廣泛的種子細胞，從目前報道來看其完全再生肌腱還不成熟，且有一定程度的異位骨化，基因轉染濃度和時間等都還需進一步探索[34]；TDSCs 被鑒定為一個獨特的干細胞群體后廣泛用于肌腱修復，但其來源有限，一定程度上限制了其發(fā)展[26]；ESCs 再生記憶功能能實現向受損組織完全復制，只是從胎兒提取用以科研和臨床不現實，大多用ESCs 來源的MSCs 構建出肌腱組織[31]。

3 生長因子促進損傷肌腱修復的研究進展

3.1 血管內皮生長因子

VEGF 是一種內皮細胞的有絲分裂原，通過激活一氧化氮合酶增加毛細血管的通透性，促進血管生成[34]。人體組織損傷修復主要依靠神經和血管參與，肌腱修復過程中最關鍵的是產生和維持有功能的微血管網絡，為肌腱生長、分化和功能化提供氧氣和營養(yǎng)物質[9,35]。VEGF 可以激活內皮細胞，刺激使其以因子在受損部位以濃度梯度募集，促進細胞整合，血管形成和成熟[36]，上調的成血管生長因子包括VEGF、FGF 和肝細胞生長因子，其都對間充質干細胞向肌腱分化起到促進作用。研究[37]提示，BMSCs 向肌腱細胞分化過程中，VEGF 通過促進相關基因表達，調節(jié)細胞周期和改善微環(huán)境，使腱細胞凋亡和腱細胞生成達到一個動態(tài)平衡，進而修復受損的肌腱組織[38]。

3.2 轉化生長因子

轉化生長因子（transforming growth factor-β，TGF-β）是一類多功能蛋白多肽，有調節(jié)細胞分化、調控細胞增殖、促進基質合成的功能，在肌腱愈合過程中較為活躍，對肌腱黏連修復影響較大[39]。Tuzmen 等[40]在兔模型中對TGF-β mRNA 的激活進行了研究，TGF-β存在于正常肌腱和腱鞘細胞，它可在肌腱損傷時被活化，mRNA 上調明顯。同時肌腱細胞、腱鞘細胞和炎性細胞中表達均上調，對肌腱的修復提供了一個雙重機制，該實驗顯示，TGF-β 在一定程度上限制損傷肌腱的黏連，阻止肌腱畸形愈合。TGF-β 轉染MSCs 成肌腱特性較強，從而達到修復肌腱的目的。

3.3 骨形成蛋白

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）具備成骨誘導活性已廣為人知，研究[41]提示，其在成肌腱分化對肌腱損傷愈合中亦有不可忽視的作用。有報道[12]BMP-12 具有誘導BMSCs 成肌腱分化的潛能，還可促進肌腱細胞增殖與分化，使組織工程化肌腱的體外構建打下基礎。通過BMP-12 與大鼠BMSCs 共培養(yǎng)，檢測發(fā)現SCX 和Tnmd 呈陽性表達，并且隨著時間推移其表達量逐漸增多，在14 d 時趨于穩(wěn)定。該實驗顯示BMP-12 可能在早期誘導肌腱再生中起主導作用。BMP-14 基因治療可顯著促進鼠跟腱撕裂傷模型的愈合，基因轉染后經生物力學測試肌腱拉伸強度顯著高于對照組[42]。

3.4 其他生長因子

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）已被證實具有促進肌腱組織愈合的作用，并已被用于基因治療。FGF 是一類可通過與細胞膜上特異受體相結合而發(fā)揮多種生物學作用的多肽分子，它對細胞的增殖、新血管形成和細胞有絲分裂都有促進作用，現已廣泛應用于各種組織修復的研究。研究[43]提示，FGF 可促進分化中肌腱細胞發(fā)生遷移和集落形成，促進軟骨細胞和腱細胞增殖和成熟，可應用于跟腱修復，促進機體愈合。胰島素樣生長因子（insulinlike growth factors，IGF-1）通過刺激細胞分化、調節(jié)細胞凋亡和誘導肌腱標志物的表達可調節(jié)MSCs 的成肌腱分化。部分學者認為IGF-1 和TGF-β 在成肌腱分化的過程是相互獨立而效應是相互疊加的[44]。此外，血小板源性生長因子、低氧誘導因子、甲狀旁腺素等在成肌腱分化過程中也起著重要作用[45]。運動醫(yī)學領域對這些生長因子的研究進展一直呈持續(xù)關注狀態(tài)。

4 展望

以干細胞為基礎的基因治療促進肌腱損傷修復近年來被提到一個新的高度，這種治療方式打破了傳統(tǒng)的醫(yī)藥康復觀念，隨著研究的深入和完善，有望建立一種全新的治療方法，給廣大肌腱損傷的患者帶來福音[46]。然而，干細胞的應用目前主要停留在動物實驗上，應用于患者還需進一步的研究。首先，腺病毒和生長因子雖然能夠增強干細胞向肌腱組織的轉化，但其時間、濃度依賴性和突變、腫瘤等問題還沒完全解決，無法進行人體實驗；其次，應用條件、技術和倫理等問題還有待探索[47]。植入的干細胞在停泊、生長、轉化、與受體組織的融合、功能發(fā)揮、神經體液調節(jié)等方面的基礎研究還需要繼續(xù)[48]。綜上所述，干細胞為基礎的基因治療有許多其他藥物無法比擬的優(yōu)點，但也存在不少未解決的問題，使用于臨床，還需進一步的研究和探索。