黃禮義，林海丹，虞樂華，白定群

(1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，重慶 400016；2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，重慶 400010)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在女性癌癥中居首位[1-2]。造成乳腺癌患者死亡的主要原因是腫瘤轉(zhuǎn)移[3]，因此，控制腫瘤轉(zhuǎn)移是治療乳腺癌的主要目標(biāo)之一。光動力療法(photodynamic therapy, PDT)是一種結(jié)合光敏劑(photosensitizer, PS)和特定波長光的新型療法，通過活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生發(fā)揮光化學(xué)作用，其安全性高、副作用小，廣泛應(yīng)用于臨床各種腫瘤治療[4]。焦脫鎂葉綠酸甲酯(pyropheophorbide-a methyl ester，MPPa)是一種葉綠素衍生物，屬于第二代光敏劑。本課題組前期實驗表明，MPPa介導(dǎo)光動力可以誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞和人卵巢癌細(xì)胞凋亡[5-6]，從而發(fā)揮治療作用，但是MPPa介導(dǎo)光動力對乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響尚未見報道。本研究擬探討MPPa介導(dǎo)光動力對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移能力的影響，以期為乳腺癌的治療提供新的思考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞與試劑 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院惠贈。光敏劑MPPa(美國 Sigma-Aldrich 公司)，以二甲亞砜(DMSO)溶解至10 mmol·L-1，避光儲存于-80 ℃冰箱；LED光源(重慶京渝激光科技有限公司)；胎牛血清FBS(德國PAN公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)； CCK-8(日本同仁公司)；DCFH-DA(美國 Sigma-Aldrich 公司)；Transwell小室(美國Millipore公司)；E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、PTEN抗體、Akt抗體、p-Akt 抗體(美國CST公司)。

1.1.2儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、全波長酶標(biāo)儀(美國 Thermo Scientific 公司)；高速離心機(jī)(美國 Sigma 公司)；生物顯微鏡(日本 Olympus 公司)；倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)；電泳儀(美國 Bio-Rad 公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(法國Vilber Lourmat公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7于37 ℃、5% CO2條件下，在含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、單藥組(僅MPPa處理)、單光組(僅光照處理)和MPPa-PDT組(MPPa和光照處理)。細(xì)胞貼壁后，單藥組和MPPa-PDT組更換為含2 μmol·L-1MPPa 的培養(yǎng)基避光培養(yǎng)，對照組和單光組更換為等體積的完全培養(yǎng)基。24 h后，去除MPPa并接受光照處理，連續(xù)輸出方式，功率密度30 mW/cm2。

1.2.2CCK-8檢測MCF-7細(xì)胞活性 MCF-7細(xì)胞以5×103個/孔接種于96孔板中，待其貼壁后進(jìn)行分組，并進(jìn)行光動力處理，光敏劑濃度為0、0.5、1、2、4 μmol·L-1，光照時間為0、30、60、90、120 s，光照能量為0、0.9、1.8、2.7、3.6 J/cm2(光照能量=光照時間×功率)。24 h后，更換培養(yǎng)基為含10% CCK-8試劑的無血清培養(yǎng)基，將細(xì)胞放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長下各孔的吸光度。按公式計算細(xì)胞存活率：存活率=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%?？瞻讓φ战M為含CCK-8培養(yǎng)基而不含細(xì)胞的孔，陰性對照組為含CCK-8培養(yǎng)基和細(xì)胞的孔，實驗組為含CCK-8培養(yǎng)基和細(xì)胞且受處理的孔。

1.2.3DCFH-DA染色檢測MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生 MCF-7細(xì)胞以5×103個/孔接種于96孔板中，待其貼壁后，隨機(jī)分組進(jìn)行光動力處理，1 h后去掉原培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入10 μmol·L-1DCFH-DA無血清培養(yǎng)基，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min。棄培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞2次，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4Transwell實驗觀察MCF-7細(xì)胞遷移能力 MCF-7細(xì)胞以1×105個/孔接種于6孔板中，隨機(jī)分組后接受相應(yīng)處理。Transwell小室放置于24孔板中，光動力處理后12 h消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基重懸，以1×105個/孔接種于Transwell小室中，下室加入750 μL完全培養(yǎng)基，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出細(xì)胞，PBS洗2遍，棉簽刮去上室中未遷移的細(xì)胞，多聚甲醛固定上室及下室30 min，三蒸水清洗小室2次，結(jié)晶紫染色5 min，三蒸水清洗2次，晾干后于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5細(xì)胞劃痕實驗觀察MCF-7細(xì)胞遷移能力 MCF-7細(xì)胞以1×105個/孔接種于6孔板中，光照前使用100 μL槍頭在孔板中劃痕，PBS洗2遍，更換培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基后接受光照處理。于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并于0、24、48 h在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6Western blot 檢測E-cadherin、PTEN、Akt、p-Akt蛋白的表達(dá)變化 MCF-7細(xì)胞接受相應(yīng)處理后，于冰上加入裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)裂解10 min，細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，超聲粉碎5次，12 000×g離心15 min，BCA法測定蛋白濃度，最終配平為等濃度、等體積的蛋白樣品。SDS-PAGE后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% 脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗4 ℃過夜，孵育二抗后顯影。

2 結(jié)果

2.1MPPa-PDT抑制MCF-7細(xì)胞活性如Fig 1所示，低濃度的MPPa(0～2 μmol·L-1)和單純光照對MCF-7細(xì)胞活性無明顯影響，高濃度的MPPa(4 μmol·L-1)對MCF-7細(xì)胞活性有較明顯的影響(P<0.05)，因此，選擇2 μmol·L-1MPPa 用于后續(xù)實驗。MPPa聯(lián)合光照處理對細(xì)胞活性有明顯的抑制作用，其抑制作用呈劑量依賴性。光能量密度為0.9 J/cm2時，細(xì)胞存活率為(52.8±2.20)%，后續(xù)實驗即采用該能量密度。

Fig 1 Effect of MPPa-PDT on MCF-7 cell

Energy density(J/cm2)=Power density(30 mW/cm2)×Illumination time(s).*P<0.05vscontrol group.

2.2MPPa-PDT誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生如Fig 2所示，ROS可將不帶熒光的DCFH-DA氧化為帶綠色熒光的DCF,DCF的量可以反映細(xì)胞內(nèi)ROS的量。MPPa-PDT處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS明顯增加，熒光強(qiáng)度高于對照組、單藥組和單光組(P<0.05)，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果表明，MPPa-PDT可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生ROS。

2.3MPPa-PDT抑制MCF-7細(xì)胞遷移Fig 3的Transwell結(jié)果顯示，與對照組、單藥組、單光組相比，MPPa-PDT組MCF-7細(xì)胞遷移數(shù)量明顯低于其他3組(P<0.05)，三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Fig 4的劃痕實驗結(jié)果顯示，24 h時，MPPa-PDT組與對照組之間細(xì)胞遷移差異不明顯，48 h時，對照組細(xì)胞遷移面積明顯大于MPPa-PDT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。上述結(jié)果表明，MPPa-PDT可以抑制MCF-7細(xì)胞的遷移能力。

Fig 2 Production of ROS and quantification in MCF-7 cells(×400)

Fig 3 Migration of MCF-7 cells inhibited by MPPa-PDT(×400)

2.4MPPa-PDT對E-cadherin、PTEN、Akt、p-Akt蛋白表達(dá)的影響如Fig 5所示，MPPa-PDT組E-cadherin、PTEN蛋白表達(dá)高于空白組、單藥組和單光組(P<0.05)，p-Akt蛋白表達(dá)低于空白組、單藥組和單光組(P<0.05)，且3個對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Akt蛋白表達(dá)4組間無明顯差異。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤治療效果不佳和腫瘤相關(guān)性死亡的主要原因之一[7]。目前，乳腺癌的治療主要以外科手術(shù)和藥物為主[8]，但外科手術(shù)和化療藥物會帶來嚴(yán)重的副作用，因此，尋找安全有效、毒副作用低的治療方法顯得尤為重要。研究表明，MPPa-PDT可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死和自噬，但MPPa-PDT對腫瘤遷移的研究尚未見報道。本研究探討MPPa-PDT對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7遷移能力的影響及其可能的機(jī)制，期望為臨床治療乳腺癌提供思路。實驗結(jié)果表明，2 μmol·L-1MPPa 聯(lián)合0.9 J/cm2光能量密度可以明顯抑制MCF-7的細(xì)胞活性。

單獨應(yīng)用一定濃度的光敏劑或者光照通常對細(xì)胞無明顯毒性，但當(dāng)二者結(jié)合時所產(chǎn)生的ROS會對細(xì)胞造成明顯的影響。ROS是PDT治療效應(yīng)的核心部分，它參與廣泛的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，研究表明，PDT通過ROS產(chǎn)生，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移[9-10]。本實驗結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞經(jīng)光動力處理后，ROS水平明顯升高，可能抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。Du等[11]發(fā)現(xiàn)，結(jié)合藻青蛋白和血卟啉介導(dǎo)光動力治療，抑制MCF-7細(xì)胞的增殖和遷移。本實驗Transwell遷移實驗和劃痕實驗結(jié)果也表明，MPPa-PDT明顯抑制了MCF-7細(xì)胞的遷移能力,而單純使用MPPa或單純光照對細(xì)胞的遷移能力無明顯影響。

Fig 4 Migration of MCF-7 cells inhibited by MPPa-PDT(×50)

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition ，EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用，EMT發(fā)生時，細(xì)胞-細(xì)胞連接和細(xì)胞極性消失，肌動蛋白細(xì)胞骨架重組失敗，紡錘樣間質(zhì)形成，導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動及遷移能力增強(qiáng)[8]。E-cadherin是EMT中一個關(guān)鍵因子，其功能失調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和轉(zhuǎn)移傳播。研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌病人中，E-cadherin水平與腫瘤轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后、腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)[8]。本實驗結(jié)果表明，MPPa-PDT上調(diào)MCF-7細(xì)胞的E-cadherin水平，表明MPPa-PDT可能通過上調(diào)E-cadherin，抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞遷移。

Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，涉及細(xì)胞的存活、生長、轉(zhuǎn)移和代謝，發(fā)生EMT的細(xì)胞中可檢測到Akt的激活，Akt激活與腫瘤侵襲遷移密切相關(guān)。PTEN作為一種抑癌基因，可使三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol trisphosphate，PI3P)脫磷酸化，抑制Akt的激活[12]，阻礙EMT的發(fā)生。實驗結(jié)果表明，MPPa-PDT處理后，MCF-7細(xì)胞中PTEN蛋白表達(dá)量增加，p-Akt蛋白表達(dá)量降低，提示MPPa-PDT可能通過PTEN/Akt信號通路，降低MCF-7細(xì)胞遷移能力。

綜上所述，MPPa-PDT可明顯降低MCF-7細(xì)胞的遷移能力，其作用機(jī)制可能與E-cadherin上調(diào)和PTEN/Akt信號通路有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMPs)在腫瘤的侵襲遷移中起關(guān)鍵作用，其中MMP-2和MMP-9可降解胞外基質(zhì)和Ⅳ型膠原[13]，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，而且MMP-9可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，因此，MMP-2和MMP-9常作為腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志物[14]。MPPa-PDT是否通過抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)來抑制腫瘤的侵襲遷移有待進(jìn)一步研究。

Fig 5 Effect of MPPa-PDT on relativeprotein expression in MCF-7

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMPPa group;△P<0.05vslight group

(致謝：本實驗在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重大代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重慶市高校重點實驗室完成，在此感謝在實驗中給予指導(dǎo)和幫助的各位老師和同學(xué)。)