許曉云，陳 倩，劉 琦，李作美

（安徽省蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，安徽蚌埠 233000）

水是生命之源，人類的生產(chǎn)活動(dòng)離不開水，水質(zhì)安全是人類健康的第一要素。隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)飲用水的安全問題日益重視，而瓶裝礦泉水飲用方便、易于攜帶，因此已成為人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢苫蛉钡娘嬈贰Ｈ羝垦b礦泉水中微生物含量超標(biāo)，輕則導(dǎo)致人體患腸道疾病，并引起嘔吐、腹瀉等癥狀，重則可致人死亡，尤其對(duì)已患病的老年人和嬰幼兒危害最大[1]。我國飲用水的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)主要有《瓶（桶） 裝飲用純凈水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》 （GB 17324—2003）、 《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》 （GB 5749—2006）、 《飲用天然礦泉水》 （GB 8537—2008） 和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)包裝飲用水》 （GB 19298—2014）。其中，《飲用天然礦泉水》2008版本要求銅綠假單胞菌不得檢出[2]，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)包裝飲用水》 （GB 19298—2014） 不再保留菌落總數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及志賀氏菌指標(biāo)，僅保留大腸菌群指標(biāo)，增加了條件致病菌——銅綠假單胞菌指標(biāo)，二者均不可檢出[3]。

1 細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定

水樣中菌落總數(shù)是指1 mL水樣在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上于有氧條件下培養(yǎng)48 h后所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。通過菌落總數(shù)可判斷生產(chǎn)的衛(wèi)生環(huán)境和瓶裝飲用水的質(zhì)量，預(yù)測(cè)飲用水的貯存期限。菌落總數(shù)多少雖然不能說明致病菌的多少，但菌落總數(shù)超標(biāo)會(huì)增大致病菌超標(biāo)的概率，在一定程度上也就增加了患病的幾率[4]。

細(xì)菌菌落總數(shù)的檢測(cè)方法有平皿計(jì)數(shù)法、涂布平板法和酶底物法。但由于細(xì)菌種類繁多，每種菌的生長(zhǎng)條件和速率都存在差異，所以計(jì)算出的細(xì)菌菌落總數(shù)只是一個(gè)近似值。

1.1 平皿計(jì)數(shù)法

平皿計(jì)數(shù)法所用的培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，將1 mL的水樣與冷卻至45℃以下的未凝固的營養(yǎng)瓊脂混勻于培養(yǎng)皿中，待凝固后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿，放進(jìn)36℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出計(jì)數(shù)[5]。營養(yǎng)瓊脂的澆灌量需一致，菌落總數(shù)不在30～300 CFU/mL范圍的樣品要重新制作（增加水樣或稀釋水樣）。

1.2 涂布平板法

涂布平板法所用的培養(yǎng)基可以為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，也可以為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。將配制好且滅菌后的培養(yǎng)基趁熱倒入無菌平板中，待凝固后再吸取0.1 mL水樣滴于培養(yǎng)皿上，用涂布棒涂均勻，平放在桌上靜置20～30 min，使菌液完全滲入，然后將平板倒轉(zhuǎn)，于37℃下恒溫培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)。涂布棒在涂水樣時(shí)可能會(huì)將水樣里的細(xì)菌帶出，為使試驗(yàn)數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確，徐維昌等人[6]為每份水樣都準(zhǔn)備了3份空白培養(yǎng)基，把水樣滴于1號(hào)培養(yǎng)基涂布后，用涂布棒于2號(hào)培養(yǎng)基上再涂1次，最后在3號(hào)培養(yǎng)基上涂1次，3份培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落總數(shù)之和即為此份水樣中所含的細(xì)菌總數(shù)。

1.3 酶底物法

近年來出現(xiàn)了一種測(cè)定菌落總數(shù)的新方法，即酶底物法。劉玉紅等人[7]通過這種方法清晰、準(zhǔn)確、快速地讀出了細(xì)菌菌落的總數(shù)。此法是將1 mL水樣和9 mL IDEXX復(fù)合酶底物技術(shù)TM酶混勻于愛德士Simplate圓盤中，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后，將樣品圓盤在黑暗處于波長(zhǎng)365 nm處的紫外燈下照射，細(xì)菌的菌落可產(chǎn)生熒光，最終根據(jù)MPN表（菌群最大近數(shù)）計(jì)出菌落的總數(shù)。

魯巍等人[8]認(rèn)為，由于飲用水中的貧營養(yǎng)環(huán)境不同于傳統(tǒng)培養(yǎng)基，所以大多數(shù)在顯微鏡下觀察到的細(xì)菌不能在傳統(tǒng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因此造成所得結(jié)果比實(shí)際結(jié)果低。國外常用AODC法和Baclight染色直接計(jì)數(shù)法對(duì)總細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，用DVC法和HPC法對(duì)活細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 大腸菌群數(shù)的測(cè)定

大腸菌群是指在一定的培養(yǎng)條件下（36±1℃，24～48 h），能夠發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧或兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。在人畜糞便污染的水中可被大量檢出，在富營養(yǎng)化的自然水體中也可檢出，因此是評(píng)價(jià)瓶裝飲用純凈水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的重要微生物指標(biāo)之一。大腸菌群的檢測(cè)方法有多管發(fā)酵法、濾膜法和酶底物法。

2.1 多管發(fā)酵法

多管發(fā)酵法是根據(jù)大腸菌群的發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的特征來檢測(cè)水樣中大腸菌群的方法。多管發(fā)酵法包括乳糖蛋白胨發(fā)酵法和乳糖膽鹽發(fā)酵法[9]。乳糖蛋白胨發(fā)酵法所用的培養(yǎng)基有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)平板培養(yǎng)基。取1 mL水樣接種于乳糖蛋白胨發(fā)酵管中，放置一杜氏小管，于36.5℃條件下培養(yǎng)24～48 h。變黃且產(chǎn)氣的再接種于伊紅美藍(lán)平板培養(yǎng)基上于36.5℃條件下培養(yǎng)24 h，對(duì)可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，挑取符合特征的菌落用乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行確證試驗(yàn)。根據(jù)陽性管數(shù)查表得出MPN數(shù)值，結(jié)果以MPN/100 mL作報(bào)告。

乳糖膽鹽發(fā)酵法所用的培養(yǎng)基有乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基和亮綠乳糖膽鹽液體培養(yǎng)基。取1 mL水樣接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管中，放置一杜氏小管，于36.5℃條件下培養(yǎng)24～48 h。取樣接種于亮綠乳糖膽鹽培養(yǎng)液中于36.5℃下培養(yǎng)24 h，同樣放一杜氏小管，如有產(chǎn)氣確定為陽性，根據(jù)陽性管數(shù)查表得出MPN數(shù)值，結(jié)果以MPN/100 mL報(bào)告。

2.2 濾膜法

濾膜法分為國標(biāo)濾膜法和酶底物濾膜法[10]。濾膜法是0.45 μm的濾膜經(jīng)過抽濾一定量的水樣（100～250 mL），而使得細(xì)菌被截留在濾膜上，隨后通過培養(yǎng)、計(jì)數(shù)和鑒定被截留菌的方法。

2.2.1 國標(biāo)濾膜法

國標(biāo)濾膜法的培養(yǎng)基為品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基和乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基。將有細(xì)菌的一面貼在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基上，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取顏色為紫紅色的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，凡為革蘭氏陰性的菌群都需接種于乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，再于37℃條件下培養(yǎng)24 h，放置一杜氏小管，若培養(yǎng)液變黃且產(chǎn)氣則判定為大腸菌群陽性，結(jié)果以CFU/100 mL表示。

2.2.2 酶底物濾膜法

酶底物濾膜法的培養(yǎng)基為酶底物技術(shù)的選擇性培養(yǎng)基。將有細(xì)菌的一面貼在酶底物培養(yǎng)基上，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，有藍(lán)綠色的菌群即證明有大腸菌群，結(jié)果以CFU/100 mL表示。

2.3 酶底物法

酶底物法的試劑是ONPG和MUG 2種營養(yǎng)指示劑[11]。大腸菌群細(xì)菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶和大腸埃希氏菌產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶能分別分解2種指示劑，而使得營養(yǎng)液呈黃色，并且在波長(zhǎng)366 nm的紫外燈下產(chǎn)生熒光。可用51孔定量盤作為試驗(yàn)的主容器，計(jì)數(shù)結(jié)果以MPN/100 mL表示。

3 銅綠假單胞菌的測(cè)定

銅綠假單胞菌原稱為綠膿桿菌，是一種革蘭氏陰性桿菌，是重要的水源和食源性致病菌。土壤、水、空氣、皮膚表面、呼吸道和腸道中都有該菌存在。它是一種條件致病菌，免疫力低下的老人和嬰幼兒易被感染，被燒傷燙傷的患者、有眼部疾病、血液病惡性腫瘤的患者，以及術(shù)后患者被感染后常使病情惡化，嚴(yán)重時(shí)可引起敗血癥。

銅綠假單胞菌的檢測(cè)方法是濾膜法。有多種培養(yǎng)基可作為選擇性培養(yǎng)基，其中最為常見的分離計(jì)數(shù)培養(yǎng)基為CN瓊脂培養(yǎng)基[12]。此法除了CN瓊脂培養(yǎng)基之外，還需要乙酰胺肉湯培養(yǎng)基、金氏B培養(yǎng)基、氧化酶試劑和鈉式試劑。將過濾后有菌的一面貼在CN瓊脂培養(yǎng)基上，于36±1℃條件下培養(yǎng)48 h，48 h后于波長(zhǎng)360±20 nm處的紫外燈下觀察。藍(lán)/綠色、無熒光的菌落則直接判定為檢出；黃色有熒光的菌落做乙酰胺肉湯（產(chǎn)氨）試驗(yàn)確認(rèn)，加入鈉式試劑，若溶液顏色從黃色變?yōu)榇u紅色，則判定為陽性、檢出；紅褐色無熒光的菌落，先做產(chǎn)氨試驗(yàn)，若結(jié)果為陽性則繼續(xù)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)。將新鮮的氧化酶滴于濾紙上，再將培養(yǎng)物涂布在上面，10 s內(nèi)顯深藍(lán)紫色的為陽性；將氧化酶反應(yīng)為陽性的培養(yǎng)物接于金氏B培養(yǎng)基上，于36±1℃條件下培養(yǎng)24 h以上，每天都取出在紫外燈下觀察，5 d內(nèi)能產(chǎn)生熒光的菌落判斷為陽性。

鄧軍[13]在用上述方法檢測(cè)銅綠假單胞菌時(shí)還做了對(duì)照試驗(yàn)，即將通過相同體積、相同水樣的濾膜貼在乙酰胺瓊脂培養(yǎng)基上，若出現(xiàn)扁平菌落且菌落周圍培養(yǎng)基變?yōu)樘壹t色則判定為檢出。CFC選擇性培養(yǎng)基也可作為分離計(jì)數(shù)的培養(yǎng)基，SN/T 2099—2008[14]中詳細(xì)介紹了配置方法，使用時(shí)應(yīng)配合氧化酶、乙酰胺、葡萄糖酸鹽等使用，其中還需要革蘭氏染色。十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基也是銅綠假單胞菌選擇培養(yǎng)基中的一種。孟凡亞等人[15]比較了銅綠假單胞菌在十六烷三甲基溴化銨瓊脂培養(yǎng)基A和B上的菌落生長(zhǎng)率。伊鋆等人[16]比較了上述幾種培養(yǎng)基的優(yōu)缺點(diǎn)，他們認(rèn)為近些年發(fā)展起來的顯色培養(yǎng)基在各個(gè)方面均占優(yōu)勢(shì)，因此最適合定性、定量分離分析。

4 霉菌和酵母菌的測(cè)定

霉菌和酵母菌都屬于真菌，二者外觀的主要區(qū)別為霉菌有菌絲體，而酵母菌無菌絲體且大多為桿狀或圓形。它們繁殖能力強(qiáng)，若攝入過多會(huì)引起人體的菌群失衡，從而對(duì)人體造成危害。

梁美丹等人[17]比較了正置培養(yǎng)和倒置培養(yǎng)的檢出率，最終得出正置培養(yǎng)的檢出率高于倒置培養(yǎng)。試驗(yàn)不但比較了2種培養(yǎng)方式，還采用了孟加拉紅和馬鈴薯-葡萄糖-瓊指2種不同的培養(yǎng)基。將水樣與培養(yǎng)基混勻后于28±1℃條件下培養(yǎng)5 d，在培養(yǎng)過程中應(yīng)每天都進(jìn)行觀察，防止霉菌過量生長(zhǎng)而導(dǎo)致菌絲交錯(cuò)影響觀察，必要時(shí)可以稀釋水樣或增加水樣的量，或用鏡檢法區(qū)分這2種菌。

張建明等人[18]認(rèn)為用顯色紙片檢測(cè)霉菌和酵母菌具有比較好的效果，尤其是酵母菌。顯色紙片是再顯色培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)制造而成，操作簡(jiǎn)單、方便攜帶，也不需要前期的準(zhǔn)備工作，更兼有價(jià)格低廉、環(huán)保經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。

5 病毒和原生動(dòng)物的測(cè)定

病毒和微生物都是較為常見的病原微生物，其中，腸道病毒在自然水域中最為常見；腸炎病毒多見于被人畜糞便污染后的水源，對(duì)懷孕的婦女影響較大；輪狀病毒會(huì)使免疫力不高的嬰幼兒出現(xiàn)死亡的癥狀。常見的原生動(dòng)物是賈第蟲和隱孢子蟲，前者會(huì)使人腹瀉，嚴(yán)重時(shí)可致人死亡；后者是其他致病微生物的中間宿主，它的蟲卵進(jìn)入人體會(huì)帶來潛在威脅。

張敏等人[19]提到檢測(cè)病毒的方法比較多，但首先應(yīng)用微孔過濾器對(duì)其進(jìn)行收集，再開展洗脫、超濾、吸絮凝等過濾步驟。常規(guī)檢測(cè)方法為直接電鏡觀察，免疫技術(shù)是一種較為精準(zhǔn)的方法，還可以運(yùn)用分子生物學(xué)的方法，但運(yùn)用這種方法時(shí)要將培養(yǎng)物反轉(zhuǎn)吸收起來，清除影響檢測(cè)結(jié)果的干擾物。馮萃敏等人[20]提到國外采用PCR技術(shù)來檢測(cè)水樣中的腸道病毒和甲肝病毒，其耗時(shí)與傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)相較縮短了50%。

檢測(cè)原生動(dòng)物一般也用顯微鏡直接觀察，但容易漏檢，因此張敏等人[19]認(rèn)為免疫熒光分子學(xué)檢測(cè)法也是認(rèn)可度比較高的方法，劉志剛等人[21]研究建立了肝吸蟲蟲卵DNA的提取和PCR檢測(cè)方法，可快速檢測(cè)到蟲卵，具有特異性。

6 檢測(cè)細(xì)菌的新型方法及應(yīng)用

ATP生物發(fā)光法[22]可以作為一種快速檢測(cè)飲用水樣中細(xì)菌總數(shù)的方法。這是一種以生物發(fā)光反應(yīng)為基礎(chǔ)的快速檢測(cè)技術(shù)，它的優(yōu)點(diǎn)在于不需要培養(yǎng)過程，大大縮短了從取樣到檢出的時(shí)間。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[23-24]是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作方便等特點(diǎn)，適用于大腸菌群和銅綠假單胞菌的檢測(cè)。

化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)[25]是一種利用抗原與抗體的特異性結(jié)合來選擇性識(shí)別和測(cè)定待測(cè)物的免疫分析方法，適用于對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等多種細(xì)菌的檢測(cè)，一般分為競(jìng)爭(zhēng)法和雙抗夾心法。

PCR技術(shù)是指在體外快速擴(kuò)增基因和DNA序列的技術(shù)，可以快速準(zhǔn)確地檢測(cè)大部分細(xì)菌，但其仍然存在一些不足之處，所以經(jīng)常與其他技術(shù)，如毛細(xì)管電泳技術(shù)協(xié)同使用[26]。而PCR技術(shù)也可以和核酸探針技術(shù)聯(lián)合使用[27]，以使其達(dá)到一個(gè)更高的精準(zhǔn)程度。

7 殺滅微生物防治微生物感染的方法與注意事項(xiàng)

7.1 造成微生物超標(biāo)的主要原因

水源受到污染[28]；生產(chǎn)車間設(shè)備條件差，沒有嚴(yán)格嚴(yán)肅的態(tài)度；滅菌操作人員不注意個(gè)人衛(wèi)生，攜帶微生物；回收的瓶、蓋消毒不徹底；運(yùn)輸中因密封不嚴(yán)而導(dǎo)致空氣中微生物進(jìn)入等。

7.2 解決方法

對(duì)水源進(jìn)行徹底消毒；相關(guān)部門加大懲罰力度和執(zhí)行力，做好教育宣傳；相關(guān)操作人員應(yīng)具備專業(yè)水平，企業(yè)應(yīng)當(dāng)提供讓他們不斷學(xué)習(xí)的機(jī)會(huì)；瓶、蓋徹底消毒，定期檢查機(jī)器；有些微生物生長(zhǎng)和瓶子的材料有關(guān)，應(yīng)避免使用微生物喜歡聚集生長(zhǎng)的材料；紫外線對(duì)一般細(xì)菌殺滅效果較好，對(duì)霉菌卻無效，這時(shí)就可以采用液體超高溫瞬間滅菌技術(shù)殺滅霉菌。

7.3 其他注意事項(xiàng)

在檢驗(yàn)微生物時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意：①檢驗(yàn)人員操作規(guī)范；②實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)保持適宜的溫度和濕度，防止微生物生長(zhǎng)過快或過慢；③保證實(shí)驗(yàn)室的無菌機(jī)器沒有損壞，可存在無菌環(huán)境。

近年來，瓶裝水微生物指標(biāo)不達(dá)標(biāo)報(bào)道頻發(fā)，我國水質(zhì)環(huán)境面臨著一個(gè)嚴(yán)峻的形勢(shì)，相關(guān)部門應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)監(jiān)督管理、嚴(yán)格執(zhí)法；同時(shí)礦泉水企業(yè)也應(yīng)當(dāng)遵守相關(guān)規(guī)定，做良心商家；消費(fèi)者更應(yīng)該擦亮眼睛，謹(jǐn)慎購買，瓶裝水一旦開蓋，盡快飲用，切勿長(zhǎng)時(shí)間存放，否則將有飲用含有超標(biāo)微生物飲用水的危險(xiǎn)。