張橋清，吳明松，劉建國(guó)，

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563099；2.貴州省普通高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨遵義市口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563006)

據(jù)研究調(diào)查結(jié)果顯示：氟中毒是由于過(guò)量攝入氟導(dǎo)致以牙齒和骨骼為主要病變的全身慢性蓄積性中毒，而砷中毒主要臨床表現(xiàn)為皮膚三聯(lián)征，包括皮膚色素脫失、色素沉著和掌跖部角化[1-2]。近年來(lái)，許多國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明氟砷聯(lián)合中毒的毒性主要表現(xiàn)為對(duì)消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼等的損傷，其對(duì)子代的生長(zhǎng)發(fā)育也有一定影響[3]。氟砷聯(lián)合中毒所導(dǎo)致的疾病稱為“氟砷中毒綜合征”，這種新的地方病已被中國(guó)、印度、日本、韓國(guó)、墨西哥和哥倫比亞等國(guó)家發(fā)現(xiàn)并得到廣泛關(guān)注[4-5]。在我國(guó)，氟、砷中毒往往相互存在，地方性氟中毒和地方性砷中毒己被國(guó)家列為21 世紀(jì)重點(diǎn)防治疾病，而貴州、新疆等地屬于地方性氟中毒和地方性砷中毒高發(fā)區(qū)[6]。為便于后續(xù)研究人員對(duì)氟砷中毒做更好的研究，本文就氟砷聯(lián)合中毒的動(dòng)物模型建立作一綜述。

1 氟砷的吸收與排泄

氟和砷可通過(guò)消化道、呼吸道和皮膚等多種途徑被人體吸收，其中消化道是最主要的吸收途徑，研究表明水溶性氟幾乎全部吸收，由于氟對(duì)骨骼和牙齒有特殊親和力，95%以上吸收的氟分布在骨組織和牙齒當(dāng)中，而砷在胃腸道吸收率為80%以上，然后經(jīng)血液運(yùn)送后主要蓄積在肝臟中[7-8]。氟與砷在腸道內(nèi)均以離子形式被擴(kuò)散吸收，氟化物在胃酸的作用下形成氟化氫，氟離子可以通過(guò)血液進(jìn)入機(jī)體與血中的鈣、鎂離子結(jié)合，從而使得血液中鈣離子、鎂離子濃度降低，導(dǎo)致鈣、鎂代謝異常。砷進(jìn)入血液后，砷可轉(zhuǎn)化為氧苯砷與血液中血紅蛋白的珠蛋白和細(xì)胞中酶結(jié)合，影響酶的活性，從而阻礙機(jī)體的代謝活動(dòng)[9]。腎臟是排泄氟的主要器官，約85%的氟由腎臟吸收過(guò)濾后排出，腎臟是氟中毒后機(jī)體最容易受損的靶器官之一[10]。尿和糞便是氟和砷的主要排出途徑，氟可較快由腎臟濾出，砷則與血紅蛋白結(jié)合，存在于紅細(xì)胞內(nèi)，機(jī)體內(nèi)的砷代謝過(guò)程主要以甲基化為主，經(jīng)過(guò)氧化還原最終生成三價(jià)二甲基砷隨尿被排出體外，還有其他少量的氟和砷經(jīng)膽汁、乳汁、皮膚、汁腺、毛發(fā)、指甲和呼出氣等排出體外[7，11]。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

研究氟、砷中毒的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類、品系繁多，建立動(dòng)物模型時(shí)應(yīng)從相似性、重復(fù)性、適用性、可控性、易行性、經(jīng)濟(jì)性等條件出發(fā)。目前實(shí)驗(yàn)常用的動(dòng)物有：大小鼠、裸鼠、豚鼠、家兔、恒河猴、比格犬以及小型豬等[12]，大小鼠價(jià)格低廉、易于大量繁殖、生活條件也容易控制，研究者選用成年大小鼠作為模型動(dòng)物居多[13-16]。在建立氟中毒動(dòng)物模型時(shí)，大小鼠有利于模擬人的受毒環(huán)境，因此成為實(shí)驗(yàn)室最常用的動(dòng)物[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠對(duì)氟的敏感性差異較大，大鼠則較為敏感，且更容易飼養(yǎng)，故大鼠是最理想的氟中毒動(dòng)物模型[19]。在研究砷的新陳代謝時(shí)，有研究表明，大鼠體內(nèi)砷的含量比其它動(dòng)物都高，且會(huì)影響砷的代謝，所以不建議使用大鼠作為動(dòng)物模型[20]。為減少模型動(dòng)物氟和砷代謝差異對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，研究以氟中毒為主導(dǎo)作用時(shí)(如砷對(duì)氟斑牙發(fā)生的影響)可使用大鼠作為模型動(dòng)物；研究以砷中毒為主導(dǎo)作用時(shí)(如氟對(duì)皮膚三聯(lián)征發(fā)生的影響)則可使用小鼠作為模型動(dòng)物。Liu等[21]發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中性別會(huì)對(duì)氟毒性存在差異，雄鼠通過(guò)尿排泄氟多于雌鼠，沉積在骨骼中的氟卻高于雌鼠，并且雄鼠出現(xiàn)早期氟中毒的癥狀晚于雌鼠。至于具體選擇哪種動(dòng)物做為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)把所研究的藥物在該種動(dòng)物體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄與人類緊密聯(lián)系起來(lái)，如在循環(huán)系統(tǒng)方面研究時(shí)可選擇與人相似的犬、猴、豬，猴的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)達(dá)且生殖系統(tǒng)與人類非常接近，也可用于行為學(xué)和生殖學(xué)的研究，犬的消化系統(tǒng)較為發(fā)達(dá)，可用于消化系統(tǒng)方面的實(shí)驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)試劑的選擇

我國(guó)飲水及煤炭中富含氟、砷元素。氟能以液態(tài)、氣態(tài)以及固態(tài)的形式存在于自然界中，液態(tài)和氣態(tài)氟化物主要是氫氟酸(HF)，也可能有少量的氟化硅(SiF4)和四氟甲烷(CF4)，固態(tài)氟化物主要是氟化鈉(NaF)、氟化鈣(CaF2)、氟化鋁(AlF3)、冰晶石(Na3AlF6)及磷灰石等。氟化鈉在市場(chǎng)上購(gòu)買簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜，且在飼養(yǎng)所用的飲水中可直接進(jìn)行添加，不需任何大型儀器，操作簡(jiǎn)單方便快捷，因此成為實(shí)驗(yàn)常用的試劑。砷廣泛分布于自然界中，但很少以單質(zhì)狀態(tài)存在，其主要存在形式是砷的化合物。砷在化合物中的存在形式主要是三價(jià)砷和五價(jià)砷，三價(jià)砷化物比五價(jià)砷化物毒性更強(qiáng)致癌效應(yīng)更高，三價(jià)砷約是五價(jià)砷毒性的60倍[22-24]。砷的化合物常見(jiàn)的有亞砷酸酥(砒霜、三氧化二砷)、砷酸酐、三氯化砷、亞砷酸鈉、砷酸鈉等。三氧化二砷應(yīng)用廣泛，在工業(yè)上可用于制造半導(dǎo)體、玻璃、搪瓷以及染料等；農(nóng)業(yè)上可用于殺蟲(chóng)劑、消毒劑的制造；臨床上可用于治療白血病、骨髓增生異常綜合征以及其它血液系統(tǒng)疾病，對(duì)惡性實(shí)體瘤(如肝癌、結(jié)腸癌等)也有很好的抗癌作用[25]，在口腔疾病中也起到一定的治療作用(如牙髓失活、口腔腫瘤)。在氟砷聯(lián)合中毒模型建立中建議使用氟化鈉和三氧化二砷試劑。

4 氟砷中毒途徑、時(shí)間及劑量

人體主要通過(guò)飲水、食物、呼吸道等途徑攝入氟砷，Lewy等[26-27]研究表明,從牙膏中攝入過(guò)量的氟是牙齒患輕度氟斑牙的危險(xiǎn)因素，藥物治療導(dǎo)致三氧化二砷含量過(guò)高也是砷中毒的常見(jiàn)原因。我國(guó)地氟病、地砷病的主要病因?yàn)轱嬎泻羞^(guò)量的氟、砷，且飲水是氟砷中毒的主要途徑，貴州和陜西等高氟高砷暴露區(qū)居民因長(zhǎng)期使用無(wú)煙囪、無(wú)爐蓋的地爐做飯和取暖，室內(nèi)空氣氟砷含量由煤炭燃燒釋放增加，從而導(dǎo)致空氣污染，室內(nèi)煤炭烘烤食物是引起氟砷中毒的另一主要原因[28-29]。迄今為止，大多數(shù)動(dòng)物模型的建立采用染毒方式以自由飲水為主。Yang等[30]在研究氟砷中毒對(duì)大鼠破骨細(xì)胞骨吸收能力的研究中用氟化鈉和亞砷酸鈉以灌胃的形式染毒，同樣造模成功。李玲[31]通過(guò)復(fù)制改良高氟區(qū)燃煤方式，利用氟病區(qū)煤烘玉米，制造高氟空氣環(huán)境，成功建立高仿真的燃煤型氟斑牙動(dòng)物模型。研究報(bào)道[32-33]大鼠飲用氟濃度為100 mg/L、砷濃度為0.12 mg/L的水3個(gè)月可引起中毒，氟砷聯(lián)合染毒采用不同的時(shí)間及劑量同樣也可造模成功。Sárk?zi等[34]采用氟化鈉組(5 mg/kg)、亞砷酸鈉組(10 mg/kg)以及氟化鈉和亞砷酸鈉聯(lián)合組研究氟、砷對(duì)運(yùn)動(dòng)行為與全身毒性的影響，以灌胃方式進(jìn)行染毒，連續(xù)染毒12周后發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)明顯減少，體重增加。Zhang等[35]將SD大鼠分別自由飲用120 mg/L氟化鈉、70 mg/L亞砷酸鈉、120 mg/L氟化鈉+70 mg/L亞砷酸鈉水溶液，染毒3個(gè)月證實(shí)氟、砷及其聯(lián)合作用可損害大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

5 造模設(shè)計(jì)

研究者們對(duì)單獨(dú)氟中毒及砷中毒模型的建立已有大量報(bào)道，顧何鋒等[36]使用Wistar大鼠分為4組飲用氟化鈉濃度分別為0、50、100、150 mg/L的自來(lái)水，8周后造模成功，大鼠切牙出現(xiàn)不同的氟牙癥表現(xiàn)，血氟、牙氟、骨氟含量顯著高于對(duì)照組，且隨濃度增加而增加，牙齒和骨骼病理學(xué)改變加重。馬栓柱等[33]用Wistar大鼠按砷的含量分為對(duì)照組(0 mg/L)、低劑量組(0.0012 mg/L)、中劑量組(0.012 mg/L)、高劑量組(0.12 mg/L)，自由飲水6個(gè)月，監(jiān)測(cè)大鼠的基本生命指征，測(cè)定各組血、尿、毛發(fā)的含砷量，各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)顯示成功創(chuàng)建飲水型砷中毒大鼠模型。張杰[37]用2因素3水平的析因設(shè)計(jì)(低氟25 mg/(kg·d-1)、高氟50 mg/(kg·d-1)、低砷0.75 mg/(kg·d-1)、高砷1.5 mg/(kg·d-1)將SD大鼠分為9組，自由飲水染毒6個(gè)月后成功建立飲水型氟砷聯(lián)合中毒動(dòng)物模型。因氟砷聯(lián)合中毒的主要方式以飲水為主，構(gòu)建模型時(shí)以飲水方式為主。設(shè)計(jì)飲水型氟砷聯(lián)合中毒模型時(shí)，可以采用析因設(shè)計(jì)分為不同組，自由飲用含氟(高氟150 mg/L、中氟100 mg/L、低氟50 mg/L)、含砷(高砷0.12 mg/L、中砷0.012 mg/L、低砷0.0012 mg/L)及其相應(yīng)混合的水溶液，對(duì)照組飲用蒸餾水。因含氟組2個(gè)月可造模成功[36]，而含砷組2個(gè)月即可出現(xiàn)明顯的砷中毒癥狀[33]，造模2個(gè)月后開(kāi)始觀察是否造模成功。由于燃煤是引起氟砷中毒的另一主要原因，氟砷聯(lián)合中毒動(dòng)物模型采用王光平和徐玉艷等[38-39]方法模擬病區(qū)居民生活習(xí)慣，復(fù)制高氟高砷空氣環(huán)境，大鼠食用燃煤烘烤的玉米作為含不同濃度氟、砷的飼料，對(duì)照組食用普通玉米飼料，各組均自由飲用氟砷含量正常的自來(lái)水，同樣采用析因設(shè)計(jì)分組，3個(gè)月后判斷是否造模成功。

6 造模成功的判斷

氟砷中毒一般分為急性氟砷中毒和慢性氟砷中毒。急性氟砷中毒以胃腸炎表現(xiàn)為主，出現(xiàn)嘔吐和腹瀉等臨床癥狀，多于數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。慢性氟砷中毒主要表現(xiàn)為對(duì)牙齒、骨骼、皮膚和神經(jīng)的損害，如氟斑牙、氟骨癥、皮膚等異常癥狀。因急性中毒發(fā)病癥狀明顯，時(shí)間短，不難做出診斷；而慢性中毒發(fā)病癥狀不明顯，時(shí)間長(zhǎng)，且是最常見(jiàn)的類型，因此是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的主要對(duì)象。判斷氟砷聯(lián)合中毒模型的建造是否成功，主要從成模時(shí)動(dòng)物的一般狀況，機(jī)體各組織器官氟、砷的水平和組織病理學(xué)檢測(cè)等方面進(jìn)行。造模成功時(shí)，動(dòng)物主要癥狀表現(xiàn)為消化和神經(jīng)功能異常，被毛無(wú)光澤、脫落，皮膚黏膜發(fā)炎，四肢無(wú)力、麻痹，皮膚感覺(jué)減退以及精神、食欲、活動(dòng)和體重等異常[17，40]。牙、骨、皮膚等是氟砷作用的靶器官，氟砷中毒可以影響其正常礦化和代謝過(guò)程，并引起代謝和病理性變化，導(dǎo)致不同程度氟斑牙、氟骨病和皮膚損害的發(fā)生，氟砷含量是判定地方性氟砷中毒的重要指標(biāo)[41-44]。氟砷含量的測(cè)定包括骨組織、血液、尿液、毛發(fā)、指甲(趾甲)、牙齒等，其中血液、尿液、骨組織、皮膚中氟砷的含量以及氟斑牙的臨床癥狀是評(píng)判氟砷中毒動(dòng)物模型構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)[43]。光鏡及電鏡下可觀察到成秞細(xì)胞體積變小，細(xì)胞器減少，排列不規(guī)則、扭曲，排列多層，極性消失，間隙不規(guī)整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯，高爾基體萎縮、線粒體腫脹，胞漿內(nèi)有基質(zhì)小泡，Tome’s突不規(guī)則或消失[17]。

7 氟砷的相互作用關(guān)系

研究表明單獨(dú)的氟和砷對(duì)細(xì)胞存活率的作用呈雙向性，即氟和砷在低濃度下可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而在高濃度下卻抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)[45-46]，加上機(jī)體各組織氟砷含量的分布、代謝與排泄不同，氟和砷存在多種相互作用關(guān)系。過(guò)量的氟和砷可以穿過(guò)血腦屏障在大鼠腦中蓄積，Jiang等[13]根據(jù)平均日攝水量，用體重280～300 g的大鼠每天攝取氟化鈉12.0～12.8 mg/kg +亞砷酸鈉7.0～7.5mg/kg，3個(gè)月后，大鼠血液、海馬和皮質(zhì)的氟砷含量顯著高于未染毒大鼠，與單獨(dú)氟或砷組相比，氟+砷組大鼠大腦皮層代謝型谷氨酸受體5 mRNA表達(dá)和海馬代謝型谷氨酸受體5蛋白表達(dá)下調(diào)，表明氟砷這兩種微量元素之間存在協(xié)同作用。Zhu等[14]在母鼠妊娠期和哺乳期飲用含氟化鈉100 mg/L、亞砷酸鈉75mg/L、氟化鈉100 mg/L+亞砷酸鈉75 mg/L的水溶液，仔鼠斷奶后飲用與母鼠同樣的溶液，第21天和42天仔鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和免疫印跡法檢測(cè)蛋白激酶、磷酸蛋白激酶、環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白和磷酸環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白表達(dá)，結(jié)果證實(shí)氟化鈉和亞砷酸鈉的相互作用關(guān)系為協(xié)同。Flora等[15]用雄性小鼠分別染毒亞砷酸鈉50 ppm和氟化鈉50 ppm及聯(lián)合染毒10周，與單獨(dú)氟砷染毒組比較，聯(lián)合用藥組超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶等的表達(dá)高于單獨(dú)氟砷組，其相互作用結(jié)果表現(xiàn)為拮抗作用。但鄭玉建等[6]用人的淋巴細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)報(bào)道，氟化鈉和亞砷酸鈉均可引起細(xì)胞DNA損傷，氟化鈉和亞砷酸鈉在高濃度(0.5 μmol/L亞砷酸鈉+50 μmol/L氟化鈉)的劑量下，細(xì)胞DNA的損傷呈現(xiàn)出協(xié)同作用，而在低濃度(0.1 μmol/L亞砷酸鈉+10 μmol/L氟化鈉)的劑量下則表現(xiàn)為簡(jiǎn)單的相加作用。周遠(yuǎn)忠等[16]用小鼠以自由進(jìn)食含氟化鈉和三氧化二砷的飼料為模型，分為對(duì)照組(普通飼料)、氟中毒組(含氟量為16.844mmol/kg)、砷中毒組(含砷量為0.400 mmol/kg)、氟砷聯(lián)合中毒組(含氟量為16.844 mmol/kg，含砷量為0.400 mmol/kg)，4組小鼠均自由飲用自來(lái)水12月，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各組小鼠的大腦、肝臟、腎臟脂質(zhì)過(guò)氧化含量升高，但其抗氧化能力降低程度尚未達(dá)到其分別作用之和，氟化鈉和三氧化二砷之間無(wú)協(xié)同作用，但拮抗作用并不明顯，也不能肯定具有拮抗作用。Sárk?zi等[34]用7周齡160g左右重量的Wistar大鼠以亞砷酸鈉(10 mg/kg)、氟化鈉(5 mg/kg)及其聯(lián)合灌胃染毒(每日一次，每周5次，連續(xù)6周)的雄性大鼠為模型，研究亞砷酸鈉和氟化鈉對(duì)運(yùn)動(dòng)行為和全身毒性的影響，通過(guò)各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果認(rèn)為亞砷酸鈉和氟化鈉兩者既不存在協(xié)同作用也不存在拮抗作用。氟砷聯(lián)合中毒在機(jī)體不同系統(tǒng)中，二者的毒性損傷作用是明確的，但交互作用不盡相同，尚無(wú)定論。因此，氟、砷聯(lián)合中毒的相互影響值得進(jìn)一步深入探討。

8 展望

目前關(guān)于氟砷聯(lián)合中毒對(duì)牙齒影響的研究甚少，牙齒是機(jī)體對(duì)氟化物最為敏感的器官，氟斑牙為氟中毒最早出現(xiàn)的特異性體征，是人體慢性氟中毒最直觀的表現(xiàn)。砷中毒對(duì)于氟中毒引起的氟斑牙是協(xié)同還是拮抗作用少見(jiàn)報(bào)道。氟砷聯(lián)合作用于牙齒的模型建立不成熟，可以先從最為常見(jiàn)的飲水型氟斑牙動(dòng)物模型開(kāi)始，并建立多組聯(lián)合用藥觀察其相互影響。此外，貴州和陜西等地是高氟高砷暴露區(qū)，燃煤導(dǎo)致氟斑牙的發(fā)生也是常見(jiàn)原因，燃煤型氟斑牙動(dòng)物模型的建立也值得深入研究。研究者們應(yīng)當(dāng)建立更好、更合適的動(dòng)物模型，為氟斑牙以及其它疾病的研究提供更可靠的動(dòng)物模型。