孫為民，查勇

（云南省腫瘤醫(yī)院/昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 腹部外科，云南 昆明 650118）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌）在惡性消化道腫瘤中病死率僅次于胃、食管，在中國范圍內(nèi)肝癌病死率在所有惡性腫瘤中排名第二，我國每年死于肝癌約11萬例，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%[1]。乙型肝炎病毒X（hepatitis B virus X protein，HBx）蛋白與肝癌發(fā)生密切相關(guān)[2]。HBx能夠維持肝癌干細胞（liver cancer stem cells，LCSCs）的干性相關(guān)表型，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到了促進作用[3]。傳統(tǒng)化療藥物，如阿霉素、5-氟尿嘧啶、鉑類等都不能有效消除腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs），而殘存的CSCs因其高度耐藥性和自我更新能力，成為腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和耐藥的根源。肝癌干細胞的存在使肝癌缺乏有效治療方法，臨床上通過手術(shù)切除、放化療、介入等治療，仍不能防止肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

1 HBx

HBx是一種小的17 kDa可溶性蛋白，由HBV基因組4個開放閱讀框架（ORF）中最小的X基因編碼，在HBV生物學(xué)和肝癌發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。HBx是一種多功能蛋白，研究表明HBx基因缺陷的HBV在體內(nèi)外病毒復(fù)制量明顯減少，提示HBx對于HBV持續(xù)復(fù)制以及在人體不斷感染起著重大作用[4]。有研究[5]表明病原微生物可以誘導(dǎo)成熟細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y干細胞，HBV促進肝癌發(fā)生便是一個例子，HBV刺激肝臟成熟細胞去編程化，轉(zhuǎn)變?yōu)長CSCs，維持自我更新。

HBV并不能直接誘導(dǎo)肝癌發(fā)生[6]，而HBx能通過轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)功能轉(zhuǎn)變，是促進肝癌進展的關(guān)鍵因子[7]。最近研究[8]顯示，HBx參與各種細胞信號傳導(dǎo)途徑，包括Wnt/β-連環(huán)蛋白（catenin），核因子κB（NF-κB），Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（STAT）以及Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等途徑。在線粒體中，HBx通過下調(diào)線粒體酶和促進活性氧（ROS）產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化作用破壞線粒體穩(wěn)定性；阻斷Fas/Fasl凋亡信號通路，干預(yù)細胞凋亡，這些變化可以解釋腫瘤細胞的能量代謝異常以及HBV相關(guān)肝癌中的細胞死亡抵抗；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，HBx通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激維持慢性肝臟炎癥和增殖[9]，以上結(jié)果提示HBx通過這些信號通路及相關(guān)機制參與到肝癌干細胞的生物學(xué)行為中，促進HBV相關(guān)肝癌發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。

此外，有研究[10]表明，當(dāng)HBV基因組整合到宿主細胞中時，作為基因突變和mRNA編輯的結(jié)果，HBx經(jīng)歷序列突變，尤其是羧基末端截短的HBx（Ct-HBx），在肝癌組織中經(jīng)常被檢測到，但在相鄰的非腫瘤組織中很少發(fā)現(xiàn)。表明Ct-HBx蛋白在肝癌發(fā)展中選擇性存在，Ct-HBx蛋白可能影響對肝癌起始和進展至關(guān)重要的生物學(xué)過程。實際上，突變HBx蛋白增加信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）、NF-κB和PI3K/Akt信號的閾值并誘導(dǎo)C-jun/MMP-10活化以促進肝癌腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移[6]。

2 LCSCs

近來研究[11]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中存在極少量CSCs，CSCs是指具有無限增殖、自我更新和分化潛能的一類腫瘤細胞，并且與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移、化療耐藥密切相關(guān)。近年來，相關(guān)專家學(xué)者在白血病、乳腺癌、肺癌、腦腫瘤、結(jié)直腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中均已成功分離出CSCs，均證實了CSCs學(xué)說[12-14]。肝癌被認為也是一種CSCs疾病，在其癌組織中同樣存在LCSCs，與臨床上肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、抵抗化療有關(guān)。越來越多的研究人員認為，提高肝癌治療療效的關(guān)鍵在于根除LCSCs，肝癌的治療可能僅僅殺死癌細胞，減少腫瘤體積，卻不根除LCSC[15]。

關(guān)于LCSCs來源有兩種學(xué)說：一是成熟肝臟細胞或膽管細胞去分化；二是肝干細胞突變。兩種不同來源細胞最后均演變?yōu)楦伟┢鹗技毎╟ancer cell of origin，CCO），共同組成LCSCs。LCSCs能夠通過DNA損傷修復(fù)、多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）表型、CSCs的相對靜止、生長通路和干性相關(guān)通路激活等途徑維持自我更新[16-17]。

LCSCs的分離鑒定一直是研究的難點，其數(shù)量較腫瘤細胞少且現(xiàn)有技術(shù)手段很難將他們分離。隨著CSCs表面分子標志物的明確，越來越多的學(xué)者對LCSCs展開研究，希望通過干性表面標志物將LCSCs從肝癌組織中成功分離出來，作為治療靶點克服癌癥復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的難題。目前已鑒定出LCSCs的多種表面標志物，主要有細胞表面抗原決定簇CD分子，包括CD133、CD90、CD44、OV6、CD24、CD13、K19、上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM亦稱CD326）等[18-21]。此外，側(cè)群（side population，SP）細胞分選也被用于CSCs的分離，SP細胞是指通過ABC（ATP binding cassette）轉(zhuǎn)運蛋白將DNA染料Hoechst 33342泵出細胞外的一類細胞群，與非SP細胞相比，SP細胞在肝癌組織中具有更高的增殖潛能、成瘤能力和抗凋亡屬性[22]。SP高表達多藥耐藥相關(guān)蛋白（ABCG2、ABCB），對常見化療藥物5-FU、多柔比星更為耐藥，而多藥耐藥相關(guān)蛋白可促進化療藥物的外排，介導(dǎo)LCSCs自我更新、致瘤性及抵抗化療藥物等特性[23-25]。表面標志物顯然不能去定義CSCs，而且更重要的是這些標志物也并非CSCs所特有。CD133存在與LCSCs表面，也存在于正常腦干細胞中，CD44與許多生理過程有關(guān)，如白細胞歸巢，被認為是胞外基質(zhì)中的主要黏附分子[26-27]。因此獨立應(yīng)用單一標志物分選得到LCSCs，在目前來說很難令人信服，而利用聯(lián)合標志物分離鑒定LCSCs在許多文獻見報道[28]。

3 HBx對LCSCs調(diào)控的相關(guān)信號通路

3.1 Wnt/β-catenin信號通路

經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)被認為是干細胞生物學(xué)中的基本途徑[29]。Wnt/β-catenin通路是進化上高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細胞增殖、分化、癌變中起著重要作用，Wnt/β-catenin信號通路異常激活后能夠促進細胞增值、調(diào)節(jié)血管生成因子如MMP-2、VEGF-A的水平而導(dǎo)致肝細胞癌的發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[30]。Shen等[31]利用Ad-HBx感染小鼠胎肝祖細胞（hepatic progenitor cells，HPCs）發(fā)現(xiàn)在HBx處理后富集在胞質(zhì)中的β-catenin蛋白轉(zhuǎn)向胞核，進一步PCR分析HBx也促進β-catenin mRNA和蛋白水平的表達，這說明在HPCs中HBx的表達激活了Wnt/β-catenin信號通路，Wnt與受體復(fù)合物結(jié)合后被激活，抑制下游蛋白質(zhì)復(fù)合物（AXIN、APC、GSK-3β）的活性，從而激活β-catenin，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF形成復(fù)合體，啟動包括c-myc、cyclin D1、CD44等一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄[32]。也有研究[33]報道，HBx增強趨化因子CXCR4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）和CXCL12表達，CXCR4/CXCL12隨后激活Wnt/β-catenin信號通路，增強OV6（+）LCSCs增殖、遷移能力，并且表現(xiàn)出對吡柔比星、奧沙利鉑及羥基樹堿化療耐藥，而在隨后加入CXCR4 抑制劑AMD3100后，OV6+肝癌干細胞特性被明顯減弱。Shen等[34]用相同劑量的索拉非尼或順鉑處理時肝癌細胞，與對照細胞相比，敲低KLF8（krupple-like factor 8，KLF8）的肝癌細胞中的細胞凋亡顯著增加，而KLF8通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路并促進化療抗性維持干細胞樣特征，在肝癌發(fā)生中起著潛在的致癌作用，因此，靶向KLF8可以提供抑制肝癌致瘤能力的有效治療方法。因此研究Wnt/β-catenin信號通路能夠幫助理解肝癌轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的分子機制，對于我們靶向此通路為徹底治愈肝癌提供參考依據(jù)。

3.2 PI3K/Akt信號通路

PI3K信號通路通過與絡(luò)氨酸殘基結(jié)合，激活P85的SH2構(gòu)域從而進一步活化P85-P110復(fù)合物或者直接通過Ras和P110直接結(jié)合，導(dǎo)致P13K的活化。激活后的PI3K與下游Akt結(jié)合，AKT能直接磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，可以抑制凋亡因子表達和增強抗凋亡因子表達，促進腫瘤細胞存活[35]。此外，Akt也能正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和Bcl-2，NF-κB與許多細胞因子和生長因子引起的細胞分化、凋亡和生存有關(guān)，在促進腫瘤細胞存活方面起著重要作用[36]。Zhu等[37]利用免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)HBV（+）/AFP（+）肝癌患者組織中干性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Klf4、Sox2 和c-myc以及抗凋亡通路中pAKT的表達均高于正常組織，隨后Western blot檢測發(fā)現(xiàn)干性標志物CD44、CD133和EpCAM相比較HBV（-）/AFP（-）組織也高表達，提示HBv可以驅(qū)動AFP表達，增加干性標志物及轉(zhuǎn)錄因子高表達，而且AFP本身很可能也是一個干性標志物。而進一步細胞學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，HBx驅(qū)動AFP表達，抑制PTEN活性，隨后激活PI3K/Akt信號通路，激活的PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)重編程相關(guān)蛋白的表達，且利用siRNA抑制AFP表達能夠抑制集落形成并抑制重編程相關(guān)蛋白和pAkt（Ser473）表達，因此AFP通過激活PI3K/Akt信號通路在誘導(dǎo)干細胞生成和促進肝細胞惡性轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用[38]。以上結(jié)果表明HBx能誘導(dǎo)肝臟正常細胞向干細胞轉(zhuǎn)化，并且HBx可以優(yōu)先驅(qū)動AFP的表達，促進重編程相關(guān)蛋白Oct4、Klf4、Sox2和c-myc表達，促進肝臟細胞惡性轉(zhuǎn)化，研究AFP/PI3K/Akt信號通路可以了解并掌控肝癌轉(zhuǎn)移及侵襲的分子機制，為進一步探討靶向LCSCs徹底治愈肝癌提供重要參考依據(jù)，其可能成為肝癌基因診斷和治療的新靶點。

3.3 STAT3/NANOG信號通路

STAT3參與許多細胞過程，如增殖、存活、抗凋亡、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移以及免疫逃逸等[39]。NANOG是干細胞效能和胚胎干細胞自我更新的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[40]。有研究[39]發(fā)現(xiàn)STAT3可以通過結(jié)合OCT3/4上調(diào)NANOG轉(zhuǎn)錄因子的表達，兩者協(xié)同維持多能性和自我更新能力。Ching等[41]研究發(fā)現(xiàn)HBx增加了干性相關(guān)基因NANOG和SOX2以及干性標志物CD133和CD47的表達，STAT3信號傳導(dǎo)活性在HBx表達細胞和HBx轉(zhuǎn)基因小鼠中增強，導(dǎo)致致癌作用，提示HBx對CSCs干性表達及維持有重要作用，而Western blot檢測分析HBx優(yōu)先誘導(dǎo)STAT3和干細胞轉(zhuǎn)錄因子NANOG的表達，在加入STAT3抑制劑S3I-201后，NANOG的表達處于下調(diào)狀態(tài)，并且球體形成實驗也發(fā)現(xiàn)HBx誘導(dǎo)的自我更新消失了。總之，這些研究結(jié)果表明HBx通過STAT3介導(dǎo)的NANOG上調(diào)增強LCSCs高致瘤性和干性特征。HBx通過調(diào)節(jié)CSCs在肝癌發(fā)展和進展中起關(guān)鍵作用，其涉及STAT3/NANOG途徑的優(yōu)先激活，更好地了解HBx蛋白的分子機制將提高對肝癌發(fā)病機制的認識，目的是為這種致命疾病開發(fā)更有效的管理。希望能開發(fā)針對HBx誘導(dǎo)的STAT3/NANOG的靶向治療以及鑒定預(yù)測疾病結(jié)果和腫瘤復(fù)發(fā)的新標記提供了新的見解。STAT3、NANOG基因可能在乙肝相關(guān)肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其可能成為肝癌基因診斷和治療的新靶點。

4 HBx調(diào)節(jié)表觀遺傳增加干性表達

表觀遺傳調(diào)控在癌癥生物學(xué)中起到了關(guān)鍵的作用，基因表達的表觀遺傳調(diào)控是一個積極和動態(tài)的過程，包括組蛋白修飾，DNA甲基化和染色質(zhì)重塑。DNA甲基化是干細胞分化過程重要的調(diào)控因子，能使干細胞向不同的亞型分化，DNA甲基化被認為是維持CSCs的潛在表觀遺傳機制[42]。異常的表觀遺傳調(diào)控與癌癥的發(fā)生直接相關(guān)，尤其是組蛋白的去甲基化，引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，進而促進癌癥進展。

組蛋白去甲基化酶（histonelysine demethylases，KDMs）能夠參與到腫瘤生長、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移以及化療耐藥等多種腫瘤行為中。Wang等[43]研究發(fā)現(xiàn)在乙肝感染相關(guān)肝癌患者病例中，肝臟祖細胞干性標志物，如EpCAM、AFP、PROM1以及NANOG大量表達在KDM5B高表達的肝癌患者當(dāng)中，并且KDM5B水平和EpCAM、AFP水平成正相關(guān)，這些結(jié)果表明KDM5B是維持干細胞特性的重要分子。而接下來作者研究發(fā)現(xiàn)，HBx能夠上調(diào)KDM5B、EpCAM、AFP、PROM1和NANOG表達，其具體機制仍然不是很明確。以上結(jié)果表明，HBx通過上調(diào)KDM5B，而KDM5B特異性去除甲基化殘留，抑制基因轉(zhuǎn)錄，增加肝癌干細胞成球、轉(zhuǎn)移和侵襲能力，而且基于KDM5B在維持干性相關(guān)中的作用，與HBx相互作用，成為肝癌患者預(yù)后不良因素。Fan等[44]研究發(fā)現(xiàn)HBx能通過DNA甲基化誘導(dǎo)EpCAM表達，EpCAM是肝癌干細胞重要的上皮黏附分子，利用染色質(zhì)免疫沉淀測定證明HBx依賴NF-κB/RelA通路，NF-κB/RelA位點位于EpCAM轉(zhuǎn)錄起始位點下游的CpG島中，敲低RelA則抑制CpG去甲基化和EpCAM表達，而在HBx表達后， RelA結(jié)合甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2、TET2和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT3L）形成復(fù)合物，激活下游轉(zhuǎn)錄因子，促進肝癌干細胞中EpCAM表達上調(diào)。有研究[45]報道，HBx也能激活DNMT，促進鈣黏蛋白啟動子甲基化，影響Wnt/β-catenin信號通路的激活，進而影響下游靶點EpCAM表達，并且DNMT對于CSC是必需的，DNMT的缺失可以通過限制CSCs庫來減少腫瘤發(fā)生。因此，靶向表觀遺傳修飾因子尤其是DNA甲基化提供了治療人類癌癥的可選策略。

5 HBx促進LCSCs的增殖及抑制凋亡

LCSCs的增殖成為肝癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的重要原因之一，如何抑制其增殖成為治療的一大研究方向。越來越多的證據(jù)表明，HBx能調(diào)節(jié)腫瘤細胞生存和凋亡途徑中多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，包括細胞周期相關(guān)蛋白（p27、cyclin D1、p21和p53）和促凋亡蛋白（PARP）等[46]。Yu等[47]研究HBx促進小鼠胚胎祖細胞（fetal HPCs，F(xiàn)HPCs）增殖實驗中發(fā)現(xiàn)這些FHPCs陽性表達EpCAM、CD133等干細胞表面標記物，在體外實驗中，F(xiàn)HPCs能轉(zhuǎn)變分化為成熟肝細胞和膽管細胞，組成肝癌起始細胞，這些行為類似于肝癌干細胞。而HBx的C末端能促進FHPCs的增殖，表明HBx能通過調(diào)節(jié)FHPCs的增殖，增加干性的表達。有研究[46,48]發(fā)現(xiàn)HBx通過降低Bax/Bcl2比例，抑制caspase-3和caspase-9的表達，進而抑制caspase下游靶標PARP（poly ADP-ribose polymerase）激活，從而抑制腫瘤細胞的凋亡。另外，HBx能通過PI3K/AKT通路中的Akt直接或者通過Raf-1和P65-PAK來磷酸化Bad的Serl36位殘基，終止Bad對Bcl-2或Bcl-XI拮抗作用，釋放后的Bcl-2或Bcl-XI恢復(fù)抗細胞凋亡的功能，而且Akt也能抑制caspase-9的活性，抑制腫瘤細胞凋亡，增強腫瘤細胞生存能力并且表現(xiàn)出對缺氧和營養(yǎng)不良的耐受[49]。以上研究結(jié)果提示，HBx通過改變細胞周期檢查點，改變細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達或蛋白水解降解來引起不受控制的細胞增殖。

6 結(jié)論與展望

肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[50]。在過去的幾十年中，自早期診斷和綜合治療進展以來，肝癌患者的預(yù)后逐漸得到改善，但是總生存率仍不理想，特別是對于失去治愈性治療機會的晚期肝癌患者。雖然手術(shù)切除和肝移植是肝癌患者的治愈性治療方法，但大多數(shù)肝癌容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，長期預(yù)后仍然不能令人滿意。對于晚期肝癌患者，經(jīng)動脈栓塞化療（TACE）是二線治療，但由于腫瘤的高化學(xué)耐藥性，其整體效果不盡如人意[28,51]。LCSCs存在于肝細胞癌中，其特征在于無限增殖，自我更新和多向分化能力，近來相關(guān)研究通過靶向干性分子標記物CD90、CD44、CD133和EpCAM等，通過聯(lián)合多個標記物可以區(qū)分LCSCs和肝癌細胞[52-55]。LCSCs的存在可能誘導(dǎo)肝癌細胞對化療抵抗以及術(shù)后復(fù)發(fā)等問題，因此，臨床肝癌治療應(yīng)更多地關(guān)注LCSCs治療，尤其在手術(shù)、放療和/或化療后必須考慮如何治療LCSCs[56]。

乙型肝炎病毒X蛋白在啟動和促進HBV誘導(dǎo)的肝癌發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。HBx調(diào)控LCSCs促進肝細胞癌轉(zhuǎn)移浸潤和復(fù)發(fā)，已經(jīng)成為HBV-肝癌發(fā)展的重要生物指標。雖然研究人員已經(jīng)確定了導(dǎo)致HBx誘導(dǎo)的肝癌腫瘤發(fā)生的一些因素，如相關(guān)干性通路的調(diào)節(jié)，基因組不穩(wěn)定性，插入突變，表觀遺傳變化和增殖以及抑制凋亡等[57]，但迄今為止，大多數(shù)研究只局限在細胞和動物模型中，尚未對人類進行全面科學(xué)研究。相關(guān)研究報道了針對HBx的5'-三磷酸RNA（3p-siHBx）的小干擾RNA可通過HBx沉默賦予有效的抗乙型肝炎病毒功效，通過3p-siHBx療法可改善HBV載體肝臟中的免疫微環(huán)境并抑制HBV復(fù)制，從而達到抑制HBx表達，消除HBx的功能[58]。HBx調(diào)控LCSCs生物學(xué)行為和功能的機制可能成為治療肝癌新的突破點，因此，在乙肝相關(guān)肝癌腫瘤中靶向HBx的策略需要進一步的研究。