陳貞年，王曉清

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德 415000）

性別決定與性別分化機(jī)制一直是動物學(xué)領(lǐng)域的熱門課題，人們不間斷地在動物性別控制領(lǐng)域投入大量精力，探索如何更加高效地控制其性別。近三十年來，隨著分子遺傳學(xué)和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的迅速普及、發(fā)展、完善。人們對性別決定機(jī)制的認(rèn)識逐漸深入到細(xì)胞水平，發(fā)現(xiàn)了與性別控制有直接關(guān)系的染色體——性染色體，這使得從基因水平上研究和控制動物的性別成為可能。

1 爬行動物性別決定研究進(jìn)展

在脊椎動物中，人和哺乳類的性別決定機(jī)制已經(jīng)做了大量研究，也取得了一些成果。但迄今，仍未解析出很多動物的性別決定機(jī)制，龜鱉類就是一例。

爬行動物的胚胎在發(fā)育過程中，要經(jīng)歷性別決定和性別分化這兩個階段。性別決定是指胚胎原始生殖腺受體內(nèi)遺傳物質(zhì)影響而向精巢或卵巢發(fā)育的過程[1]，而性別分化則是指建立起次級特征的全部形態(tài)變化及生理變化差異。目前，爬行動物的性別決定類型可劃分為兩大類：一類是基因型性別決定（Genetic sex determination,GSD），指源于性染色體上的性別決定基因先導(dǎo)調(diào)控并誘導(dǎo)相關(guān)性別決定基因級聯(lián)反應(yīng)的過程，最終調(diào)控原始生殖腺朝精巢方向或卵巢方向定向發(fā)育的過程。爬行動物的基因型類型可分為：①XY型，XY表現(xiàn)為雄性，XX表現(xiàn)為雌性；②ZW型，ZZ表現(xiàn)為雄性，ZW表現(xiàn)為雌性。另一類是環(huán)境型性別決定（Environmental sex determination，ESD），指后代的性別分化不依賴遺傳物質(zhì)的組成，而是受控于胚胎發(fā)育時的環(huán)境因子（如溫度、光照、濕度、類固醇激素等），最典型的環(huán)境型性別決定是溫度依賴型性別決定（Temperature-dependent sex determination，TSD）。

自從1962年Becak首次在爬行動物中發(fā)現(xiàn)異型染色體之后，人們也漸漸地在其他爬行動物中發(fā)現(xiàn)了性染色體的存在，其中分化程度最為明顯的是蛇類，屬于ZW/ZZ型。Schartl[2]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蜥蜴目7科70多種都存在性染色體，一部分屬于ZW型，一部分屬于XY型。在龜鱉目中，北美泥龜科十字龜屬中的兩種（S.valvini、S.tripocatus）具有 XX/XY 型性染色體[3]。

2 溫度對性別決定的研究

在爬行類、兩棲類和少數(shù)魚類中普遍存在溫度依賴型性別決定[4-6]。Charmier[7]在1966年首次報(bào)道爬行動物性別受孵化溫度的影響，Pieau[8]在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)溫度是影響性別決定的主要因子，并提出了溫度依賴型性別決定類型。Bull等[9,10]研究了5種龜類的性別后提出了TSD機(jī)制。Ewert等[11]將溫度依賴型性別決定分為三種：①M(fèi)F（TSDⅠa）型，指低溫產(chǎn)雄性，高溫產(chǎn)雌性；②FM（TSDⅠb）型，指高溫產(chǎn)雄性，低溫產(chǎn)雌性；③FMF（TSDⅡ）型，指低溫和高溫均會產(chǎn)雌性，而中間溫度則產(chǎn)雄性。而朱新平等[12]的研究則表明，黃喉擬水龜Mauremys mutica Cantor的性別決定屬于TSD機(jī)制，為TSDⅠ型，其臨界溫度值為29℃。與黃喉擬水龜相同，珍珠鱉Apalone ferox Schneider的性別決定也屬于TSD機(jī)制，為TSDⅠa型，即高溫產(chǎn)雌性，低溫產(chǎn)雄性，其臨界溫度值為28℃[13]。

近年來，隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的普及與發(fā)展，龜鱉類性別決定的關(guān)鍵基因漸漸被發(fā)現(xiàn)與克隆，在龜鱉類的TSD機(jī)制研究上也取得了新進(jìn)展[14,15]。研究發(fā)現(xiàn)，龜鱉類性腺中的Dmrt1、Sox9、Mis、Sf1、Amh、Dax1、Wt1 和 Foxl2 等性別決定基因受溫度因子的調(diào)控。當(dāng)溫度改變時，這些關(guān)鍵調(diào)控因子也會做出相應(yīng)的變化[16-18]。

在TSD類型的爬行動物中，性腺發(fā)育有個特殊的溫度敏感期（Temperature sensitive period，TSP），指動物胚胎發(fā)育到某特定階段時，孵化的溫度對性別起到?jīng)Q定性作用，這是動物胚胎性別出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)的特殊時期[19,20]。溫度敏感期一般是在整個胚胎孵化周期的前1/3時期（第14～21期內(nèi)）。動物溫度敏感期存在種間差異，同一種動物的溫度敏感期也存在性別差異。例如，淡水龜鱉類的胚胎發(fā)育周期可分為27期，海龜?shù)呐咛グl(fā)育周期可分為31期[21]；紅耳龜Trachemys scripta雄性周期在16～21期，雌性周期在 17～19 期[22]；Tokita 等[23]將中 華 鱉 Pelodiscus sinensis從神經(jīng)胚到出殼期劃分為23期，劃分從孵化的第2d（第5期）開始，至孵化的第48d（第27期）結(jié)束；錦龜Chrysemys picta的敏感溫度期在第16～22期，若孵化溫度低于25℃，溫度敏感期可能在16期前并影響性腺的分化[24]；謝萬奎[25]研究發(fā)現(xiàn)，歐洲甲魚的性別分化對溫度的敏感度特高，不同的孵化溫度直接影響子代的性別，孵出不同性別的稚鱉。

3 溫度對中華鱉性別決定的影響

目前對孵化溫度與中華鱉性別決定的關(guān)系做了很多研究，但結(jié)果仍存在較大爭議。朱道玉和孫西寨[26]研究發(fā)現(xiàn)，在24～34℃時，隨孵化溫度的上升雌性率降低，雄性率升高，溫度24℃時，雌性率最大，溫度32℃時，雄性率最大。孫西寨[27]和唐瑤[28]的實(shí)驗(yàn)也得到相同的結(jié)果，認(rèn)為中華鱉屬于溫度依賴型，而不依賴于遺傳物質(zhì)決定。阮成旭和袁重桂[29]發(fā)現(xiàn)，在32℃下孵化的中華鱉雄性率高達(dá)72.1%，而在27℃下孵化，雄性率只有42.3%，調(diào)控孵化溫度可以改變中華鱉的性別比例。巫旗生等[30]發(fā)現(xiàn)，調(diào)控孵化溫度可以調(diào)控中華鱉胚胎的性別分化，子代雄性率隨溫度升高而上升，雌性率隨著溫度升高而降低。高麗麗[31]根據(jù)360枚中華鱉卵孵化的結(jié)果推斷中華鱉屬于溫度依賴型性別決定機(jī)制。

而聶劉旺等[32]的研究結(jié)果卻與朱道玉等的結(jié)果相反，他發(fā)現(xiàn)中華鱉的性別分化受孵化溫度影響為MF型，即隨著溫度的升高，雌性率上升，雄性率降低。羅曼等[33]發(fā)現(xiàn)孵化溫度在24～26℃時，孵出稚鱉的雄雌比大于1，而孵化溫度在27～29.5℃時，孵出稚鱉的雄雌比小于1，觀察體細(xì)胞沒有發(fā)現(xiàn)異型染色體。任少亭等[34]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了羅曼等的觀點(diǎn)。

研究表明，龜鱉類中存在TSD性別決定機(jī)制[35-39]。賀斌等[40]研究發(fā)現(xiàn)，溫度影響 Sf1、Mis、Sox9、Dax1、W t1和Dmrt1等參與龜鱉類的性別分化基因的表達(dá)。而李慧君[41]則認(rèn)為中華鱉中有些基因的表達(dá)受溫度因子調(diào)控，但孵化溫度與性別決定之間的聯(lián)系、以及溫度調(diào)控相關(guān)性基因表達(dá)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 雌雄激素對龜鱉類性別分化的影響

龜鱉類胚胎隨著發(fā)育，雙向潛能性腺在經(jīng)歷髓質(zhì)的發(fā)育和皮質(zhì)的退化后形成精巢；而雙向潛能性腺在皮質(zhì)的發(fā)育和髓質(zhì)的退化后則形成卵巢[42]。雌激素對整個胚胎發(fā)育過程起重要作用，雌激素能促進(jìn)性腺皮質(zhì)發(fā)育，抑制髓質(zhì)發(fā)育，影響胚胎的性腺分化[43,44]。研究表明，在雄性孵化溫度條件下，將雌二醇激素注入菱斑龜Malaclemys terrapin、密河鱷Alligator mississippiensis、恒河鱷 Gavialis gangeticus的胚胎，可誘導(dǎo)胚胎性腺朝向卵巢方向分化[45]。葉玉珍等[46]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲基睪丸素具有促使中華鱉胚胎性別趨向雄性轉(zhuǎn)化，而唐瑤[28]則認(rèn)為甲基睪酮并不能改變中華鱉個體自身性別分化方向，更不能使仔稚鱉發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，可能只對個體的生長發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。胡增高[47]研究了中華鱉血漿中性激素含量的季節(jié)性變化，發(fā)現(xiàn)雄中華鱉在發(fā)情高峰期血漿中性激素含量最高；烏龜、黃喉擬水龜和中華鱉的性激素季節(jié)性變化比較發(fā)現(xiàn)，雌性中華鱉血漿中雌二醇含量隨卵巢卵泡的增長和發(fā)育而逐漸提高，當(dāng)卵巢發(fā)育成熟時血漿中雌二醇含量達(dá)到最大值，而雄性中華鱉在繁殖期血漿睪酮含量高，說明睪酮對精子的形成與成熟至關(guān)重要。雄黃喉水龜中睪酮激素含量最高，中華鱉中含量最低；雌中華鱉中雌二醇激素含量最高，烏龜中含量最低[48]。于文萍[49]的研究也發(fā)現(xiàn)，中華鱉睪酮與生精作用和卵泡生長密切相關(guān)，而卵黃的形成和精原細(xì)胞、精母細(xì)胞以及精子的發(fā)育成熟均離不開雌二醇的作用。在整個胚胎性腺發(fā)育過程中，AR、ERα和芳香化酶的表達(dá)貫穿始終，說明在性腺分化前，雄激素、雌激素和芳香化酶就已經(jīng)開始發(fā)揮作用[49]。Parker等[50]在分子水平上發(fā)現(xiàn)，Sf1能控制細(xì)胞表達(dá)性腺類固醇激素發(fā)生酶，其中包括芳香化酶在內(nèi)。王莉等[51]發(fā)現(xiàn)，雌激素一方面是通過抑制Dmrt1和Sox9這兩個雄性因子表達(dá)來抑制胚胎向雄性分化，又促進(jìn)卵巢的生長發(fā)育，促使胚胎向雌性發(fā)育，揭示雌激素對中華鱉胚胎性別分化的調(diào)控作用。

5 有關(guān)性別遺傳決定機(jī)制的研究

近年來，已有研究表明，中華鱉存在微小性染色體（Z/W），屬于GSD機(jī)制[17,52-55]。在中華鱉33對染色體中，1～6號為大型染色體，其余均為小型染色體。各種實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)，Kawai等[53]運(yùn)用熒光原位雜交（FISH）定位技術(shù)，在中華鱉中發(fā)現(xiàn)了異性染色體；Badenhorst等[56]通過同源染色體配對表明，中華鱉和刺鱉Apalone spinifera均存在異性染色體（ZZ/ZW）。Literman等[57]通過實(shí)時定量PCR來鑒定中華鱉性染色體型。唐偉等[58]采用秋水仙素處理和核型分析驗(yàn)證中華鱉性染色體型為ZZ/ZW型（ZZ型為雄性；ZW型為雌性），并得出其核型公式為2n=66=4m+4st+34sm+22T+ZZ/ZW。

在性別調(diào)控關(guān)鍵基因的研究中，孫偉等[59]和蔡晗等[60]通過慢病毒介導(dǎo)鑒定了Dmrt1和Amh基因?yàn)橹腥A鱉雄性分化的關(guān)鍵基因。包海聲等[61]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在中華鱉性腺分化前Cyp19a1在雌性中特異性表達(dá)，經(jīng)過芳香化酶抑制劑（AI）處理及Cyp19a1-shRNA處理后，ZW型的胚胎性腺皮質(zhì)區(qū)漸漸退化，而髓質(zhì)區(qū)卻高度發(fā)育，最終形成原始性索結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出由雌性向雄性發(fā)育的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。認(rèn)為Cyp19a1是調(diào)控卵巢早期分化的重要因子，在啟動雌性分化通路中起關(guān)鍵作用。Matsumoto等[62,63]發(fā)現(xiàn)，Cyp19a1在雌紅耳龜性腺分化關(guān)鍵時期中大量特異性表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，Dmrt1和Foxl2與Cyp19a1密切聯(lián)系，Dmrt1和Foxl2可直接調(diào)控Cyp19a1。Shoemaker等[64]發(fā)現(xiàn)，在巴西龜?shù)臏囟让舾性缙?，胚胎的性腺中都檢測到Sox9的表達(dá)。但到了溫度敏感的中后期就出現(xiàn)了表達(dá)差異，表現(xiàn)為在雄性性腺中Sox9表達(dá)顯著上升，在雌性中顯著下降。這表明Sox9對于胚胎精巢的生長發(fā)育至關(guān)重要，對胚胎的性別分化有一定的影響。在八孔海龜Lepidochelys olivacea的性別決定中后期，Sox9在雄性性腺中高度特異性表達(dá)，被認(rèn)為是雄性性別分化的關(guān)鍵基因之一[65]。Barske等[66]用β-雌二醇處理巴西龜胚胎，使在雄性溫度下形成的胚胎發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，對比發(fā)現(xiàn)，Sox9在雌性中的表達(dá)水平顯著降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)源性雌激素抑制了Sox9的表達(dá)，促使性腺向雌性發(fā)育。Matsumoto等[67]用芳香化酶抑制劑誘導(dǎo)雌性溫度下的胚胎向雄性發(fā)育，并檢測到Sox9的表達(dá)水平顯著上調(diào)。Dmrt1在紅耳龜Trachemys scripta和太平洋麗龜Lepidochelys olivavea等龜鱉類胚胎中的表達(dá)存在顯著差異[68,69]，即在雄性中的表達(dá)顯著高于雌性。牟毅[70]發(fā)現(xiàn)，孵化溫度對中華鱉的性別無顯著影響，比較基因組雜交結(jié)果顯示，在兩個爭議種群的雌性成體中具異型性染色體，表明這兩個種群的性別決定為GSD且屬ZZ/ZW系統(tǒng)；并提出了新的假說——有效雌二醇積累（sumeE2）閥值假說，合理的闡釋了溫度對爬行動物胚胎性別的決定作用。

6 小結(jié)

爬行動物的性別決定過程是一個復(fù)雜的、多個性別相關(guān)基因精確調(diào)控以及有多種激素參與的過程，性別調(diào)控關(guān)鍵基因的篩選和功能鑒定是解析性別決定分子機(jī)制的關(guān)鍵。目前龜鱉類性別決定相關(guān)基因功能的研究還較薄弱，尚未建立溫度、激素以及基因三者的級聯(lián)作用模型。隨著分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的普及、進(jìn)步、完善，相信不久的將來一定可以解析其性別決定分子機(jī)制。