田飛焱，歐陽敏，謝世紅，徐節(jié)華，劉文珍，孟霞，銀旭紅，花麒

（江西省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，江西 南昌 330046）

鯉春病毒血癥病毒（Spring Viremia of Carp Virus,SVCV）可引起鯉科魚類大規(guī)模暴發(fā)鯉春病毒血癥（Spring Viremia ofCarp,SVC），該病是一種急性、高致病性的傳染性疾病，曾在歐洲很多國家發(fā)生，給當(dāng)?shù)仵庰B(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,2]。2003年以來我國不斷檢測到SVCV，在個別地區(qū)暴發(fā)SVC疫情，表明SVC在我國逐步蔓延[3,4]。SVC發(fā)生和傳播對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，特別是鯉科魚類的養(yǎng)殖構(gòu)成潛在威脅，因此深入研究其病原的自然感染率、地區(qū)分布、遺傳變異等流行病學(xué)特征，對疾病的監(jiān)測、防控及診斷試劑和疫苗的研發(fā)都具有重要意義。

本研究于2005—2017年間，應(yīng)用細(xì)胞分離法和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,PCR）方法監(jiān)測了江西省一些重要漁場養(yǎng)殖鯉科魚類SVCV，比較了不同地區(qū)SVCV分離株的分子特征，旨在摸清本省SVCV流行情況，提高疫病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警防控能力，保障江西省養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2005—2017 年春秋季，根據(jù)SC/T 7103-2008[5]的采樣要求，組織縣級水生動物防疫站在全省范圍內(nèi)的漁場采集鯉科魚類活體樣品，采樣水溫范圍11～20℃，每個漁場每年只采集一份樣品，每份樣品采集數(shù)≥150尾（假定某一魚類養(yǎng)殖群體≥100 000尾，2%感染率），依照GB/T15805.5-2008檢測方法[6]進(jìn)行檢測。

1.2 病原監(jiān)測

按照GB/T 15805.5-2008規(guī)范，將樣品組織懸液接種到鯉上皮瘤細(xì)胞（EPC）中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect,CPE）；用套式RT-PCR方法擴(kuò)增SVCV的糖蛋白（G）基因片段，依照標(biāo)準(zhǔn)綜合判定是否存在SVCV感染。引物序列為：SVCV-R2：5’-AGATGGTATGGACCCCAA TACATHACNCAY-3’；SVCV-R4：5’-CTGGGGTTT CCNCCTCAAAGYTGY-3’；SVCV-F1:5’-TCTTGGA GCCAA ATAGCTCARRTC-3’。其中F1和R2用于擴(kuò)增714bp片段，而F1和R4則從中再擴(kuò)增606bp的片段。

1.3 序列分析

陽性樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)基因測序后用DNAS-tar對測序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列同源性分析，從GenBank中選取與陽性序列相似的參考毒株，用MEGA7.0軟件采用鄰位相連法（Neighbor-joining）構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測結(jié)果

2005—2017 年的春秋季在江西11個地市的69個縣（市、區(qū)）隨機(jī)采集、檢測了576份樣品（表1）。其中錦鯉樣品64份，鯉樣品113份，鯽Carassius auratus樣品177份，草魚Ctenopharynogodon idellus樣品202份，草金魚Carassius auratus樣品2份，鰱Hypophthal michthys molitrix樣品13份，鳙Aristichthysnobilis樣品3份，鳊Parabramis pekinensis樣品1份，刺鲃Spinibarbus caldwelli樣品1份。共監(jiān)測到SVCV陽性樣品23份（表2），總的陽性檢出率為3.99%，其中2009以前的5年僅2007年有2份陽性樣品檢出，2010年起陽性樣品檢出增多，其中2012—2016年連續(xù)5年均有陽性檢出。

表1 2005～2017年江西省漁場SVCV監(jiān)測情況Tab.1 SVCV surveillance in Jiangxi Province,China,from 2005 to 2017

2.2 流行特征

2.2.1 種類分布

本研究采樣的（品）種類覆蓋度較高，包含鯉科的錦鯉、鯉、草魚、鯽、草金魚、鰱、鳙、鳊和刺鲃，其中從錦鯉、鯉、草魚、鯽中檢出陽性樣品數(shù)分別是4、2、3和14個，占各（品）種類樣品數(shù)的6.25%、1.77%、1.48%和 7.91%，草金魚、鰱、鳙、鳊、刺鲃樣品中未檢出陽性樣品。鯽的陽性檢出率最高，其次是錦鯉，鯉和草魚陽性檢出率相對較低。統(tǒng)計(jì)分析與χ2檢驗(yàn)表明，鯽的SVCV的攜帶率與鯉（P＜0.05）、草魚（P＜0.01）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與錦鯉的SVCV的攜帶率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2.2 季節(jié)分布

2005—2017 年在江西省春季采集樣品312份，水溫范圍11～20℃，檢出陽性15份，陽性檢出率4.81%；秋季采集樣品264份，水溫范圍11～20℃，檢出陽性8份，陽性檢出率3.03%。春、秋季的SVCV的陽性檢出率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），即春秋季節(jié)SVCV的陽性檢出率無顯著差異（表2）。

表2 江西省漁場2005—2017年SVCV陽性樣品信息Tab.2 Information regarding SVCV isolates in Jiangxi Province,China,from 2005 to 2017

2.2.3 遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)SVCV G基因序列的遺傳進(jìn)化，SVCV分離株可分為4個基因亞型：Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc和Ⅰd[7,8]。用MEGA7.0將獲得的部分江西分離株的G基因部分序列和SVCV各基因型序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹表明，江西分離株與中國株772、461、A1、BJ0505-02、SVCV-265；亞洲株 D148、英國株 H264、G108；美國株 North Carolina Isolate of2002、500549、316715；加拿大株HHOcarp06等在同一分支上，親緣關(guān)系較近，聚為一類，同屬于Ⅰa基因亞型；與其他基因型分離株在不同的分支上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖1）。江西分離株的同源性分析顯示：獲得的江西分離株同源性非常高，達(dá)到95.5%，部分江西分離株之間同源性達(dá)到了100%，SVCV江西分離株間的親緣關(guān)系較近，本地區(qū)存在SVCV的近距離傳播

圖1 江西省SVCV分離株與其他地區(qū)的SVCV分離株部分G基因序列的遺傳進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic trees based on partial glycoprotein gene sequences of SVCV isolates from Jiangxi Province and other SVCV species in Genbank

2.2.4 區(qū)域分布

本研究采樣區(qū)域較廣，覆蓋了全省11個地市的69個縣（市、區(qū)）。2009年以前江西省僅在南昌縣發(fā)現(xiàn)SVCV，2010年起發(fā)現(xiàn)SVCV分布范圍逐步擴(kuò)大，截止目前江西省僅新余市、撫州市未發(fā)現(xiàn)SVCV分布，其余9個地市均發(fā)現(xiàn)SVCV，陽性漁場主要集中在贛中的南昌縣、新建縣、上高縣；贛西的安?？h、吉安縣、上栗縣；贛東的廣豐區(qū)、貴溪市；贛北的彭澤縣、廬山市；贛南的信豐縣、石城縣。江西省SVCV陽性樣本分布區(qū)域較為分散，陽性漁場在地理上呈零星分布，分布范圍較廣。

3 討論

鯉春病毒血癥（Spring Viremia of Carp,SVC）是鯉科魚類的一種急性出血性并高度傳染的流行病，通常在春季水溫10～20℃時流行，引發(fā)幼魚和成魚大量死亡。100多年來SVC在歐洲各國（包括俄羅斯）流行，給歐洲的鯉養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2,9,10]。本研究2005—2017年持續(xù)進(jìn)行SVCV感染流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：在錦鯉、鯉、草魚、鯽中均檢出SVCV，鯉科魚類帶毒較為廣泛，陽性檢出率從高至低依次為：鯽7.91%、錦鯉 6.25%、鯉1.77%、草魚1.48%，其中鯽和錦鯉的陽性檢出率相對較高。Eveline等[11]用浸泡和注射方式將SVCV美國株（AY527273/North Carolina Isolate of 2002）感染錦鯉、黃鱸Diploprion bifasciatum、大馬哈魚Oncorhynchus keta等6種不同科的魚類，結(jié)果表明SVCV對錦鯉高度易感染。統(tǒng)計(jì)分析與χ2檢驗(yàn)表明：江西省采集的樣品中鯽的SVCV的攜帶率與鯉（P＜0.05）、草魚（P＜0.01）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與錦鯉的SVCV的攜帶率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），即鯽的SVCV的攜帶率顯著高于鯉、草魚，與錦鯉相當(dāng)。說明在本地區(qū)除錦鯉外，鯽也是一種SVCV高度易感種，發(fā)生該疫病的風(fēng)險(xiǎn)也較高。在江西省春、秋兩季均能檢測到陽性樣品，春、秋季節(jié)與陽性檢出率間無相關(guān)性，11～20℃的水溫范圍內(nèi)有陽性樣品檢出。

系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，江西分離株與中國株（SVCV-265、772、461、G067、A1、BJ0505-2）、亞洲株（D148）、英國株（H264,G108）、美國株（North Carolina Isolate of 2002、316715、500549）、 加 拿 大 株（HHOcarp06）等在同一分支上，親緣關(guān)系較近，聚為一類，屬于Ⅰa基因亞型，這與Zhang等[12]構(gòu)建的進(jìn)化樹中亞洲分離株主要屬于Ⅰa基因亞型的結(jié)論一致。聚為一類可認(rèn)為來源相近，表明江西分離株與已發(fā)表的中國分離株、美國株來源相近。2005—2017年江西省所有檢測出SVCV的陽性漁場經(jīng)流行病學(xué)現(xiàn)場調(diào)查均未發(fā)生SVC。Xiao等[13]將SVCV中國株（SVCV-265）人工感染錦鯉，試驗(yàn)亦未觀察到錦鯉有明顯的臨床癥狀和死亡現(xiàn)象，但同屬于Ⅰa基因亞型的美國株（North Carolina Isolate of2002）曾導(dǎo)致2002年美國的北卡羅來鈉州暴發(fā)SVC[14,15]，表明不同區(qū)域的環(huán)境因素影響Ⅰa型SVCV的致病性。因此，Ⅰa型SVCV感染鯉科魚類并引起發(fā)病的因素還有待進(jìn)一步的研究，Ⅰa型SVCV陽性的鯉科魚類養(yǎng)殖場依然存在發(fā)生SVC的風(fēng)險(xiǎn)。

2009年以前江西省僅在南昌縣發(fā)現(xiàn)SVCV，2010年起陸續(xù)在全省其他漁區(qū)發(fā)現(xiàn)，SVCV存在省內(nèi)近距離傳播，分布點(diǎn)近些年也有所擴(kuò)散，表明感染區(qū)域范圍有逐漸擴(kuò)大的趨勢。SVCV主要是水平傳播（帶毒魚、被污染的水、網(wǎng)具等）[16]。江西省主要有贛江、撫河、信江、饒河、修河等五大水系，水流均最終匯入鄱陽湖及周邊湖泊。本研究主要監(jiān)測江西省內(nèi)漁場的養(yǎng)殖鯉科魚類情況，尚未監(jiān)測野生魚類。從江西水系分布來看，全省主要水系通過鄱陽湖密切相連，一旦SVCV傳染到河流內(nèi)的野生魚類，通過帶毒魚和病毒污染的水體傳播，可能會加劇該病疫情在江西更大范圍傳播的風(fēng)險(xiǎn)。因此，為了降低SVC病原的傳播和擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)，需要擴(kuò)大疫情監(jiān)測范圍（包括野生魚類），加強(qiáng)生物安保意識的宣傳，提高漁民在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中對染疫對象的生物無害化處理意識，筑牢生物安全屏障。