陶志文

（南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 江蘇 南京 210029）

造影劑腎病是院內(nèi)獲得性腎功能不全的第三位因素，其定義為應(yīng)用造影劑后48～72小時(shí)肌酐升高較基線水平大于25%或者絕對(duì)值增加0.5mg/dL(44.2μmol/L)。有研究調(diào)查表明在廣泛應(yīng)用造影劑的人群中，造影劑腎病的發(fā)生率在約2%。然而在高危人群中造影劑腎病的發(fā)生率約在20%～30%［1-5］。已有充分?jǐn)?shù)據(jù)表明急性心肌梗死PCI導(dǎo)致的造影劑腎病的發(fā)生率顯著高于擇期PCI手術(shù)患者［6-7］。既往有研究揭示了造影腎病的發(fā)生是由于急性腎損傷，根據(jù)以往研究和調(diào)查，造影劑腎病的發(fā)生機(jī)制包括了以下方面，（1）腎循環(huán)改變導(dǎo)致的缺血缺氧，（2）造影劑的直接腎毒性和氧化應(yīng)激，（3）急性心肌梗死這種特殊病理生理狀態(tài)[8-11]。目前急性心肌梗死狀態(tài)造影劑對(duì)腎臟的損害的病理過(guò)程仍不清楚。因此，本研究的目的是進(jìn)一步明確造影劑腎病在急性心肌梗死狀態(tài)發(fā)生率升高的機(jī)制。

1.研究方法

1.1 心肌梗死模型建立和實(shí)驗(yàn)分組

大鼠過(guò)夜禁水大約12小時(shí)，通過(guò)結(jié)扎大鼠前降支構(gòu)建心肌梗死模型，并最后行心臟超聲檢查確定心肌梗死模型建立成功。未結(jié)扎前降支的大鼠分為對(duì)照組control（n=8）和造影劑組CM（n=12）,結(jié)扎前降支的大鼠，分為心肌梗死組AMI（n=8），心肌梗死+造影劑AMI+CM(n=12)。CM組和AMI+CM 組注射造影劑，劑量為2g 碘/kg，Control組和AMI組注射等劑量生理鹽水。

1.2 血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)

各組術(shù)后45min，大鼠行心臟超聲檢查，檢查心臟室壁運(yùn)動(dòng)功能及左室射血分?jǐn)?shù)，CM組和AMI+CM組在基線水平檢測(cè)各組右側(cè)腎動(dòng)脈血流速度，然后分別注射造影劑記錄各組在0min,2min,8min,15min,4h,24h的腎血流速度的數(shù)值（VRABF）。

1.3 造影劑滯留觀察

在CM組和AMI+CM組，隨機(jī)取四只進(jìn)行腎CT掃描，記錄注射造影劑前基線水平，注射造影劑后4h和12h，觀察造影劑在腎臟內(nèi)存留情況，并計(jì)算腎皮質(zhì)的CT掃描得出的對(duì)比度值。

1.4 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

在各組處死后行下腔靜脈抽血，然后分別測(cè)各個(gè)指標(biāo)。血肌酐采取 Jaffe反應(yīng)比色法測(cè)定。血清ET-1和Ang-Ⅱ采取按照試劑廠商說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 腎臟組織活性氧族檢測(cè)

各組處死后取右側(cè)腎臟，按照杰美公司的試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)520nm。最終得出各組的熒光讀數(shù)，最后以control組作為基線對(duì)照。每組腎臟組織各取100mg，進(jìn)行提取RNA，方法如下：勻漿處理：將組織在液氮中磨碎,每100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。然后進(jìn)行cDNA的合成，引物設(shè)計(jì)通過(guò)Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物 NF-ΚB p53mRNA為 5-CCAAAGACCCACCTCACC-3(forward)and 5-CGCATTCAAGTCATAGTCCC-3(reverse),Caspase-3的引物為5-GCTGAGTATGTCGTGGAG-3(forward) 和5-TCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3(reverse).GAPDH 的引物為 was 5- CTGGACTGCGGTATTGAG-3(forward)and5- GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3(reverse)。逆轉(zhuǎn)錄合成通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR儀合成cDNA，然后在通過(guò)Real-time PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后，得到每孔的CT，最后通過(guò)GAPDH作為內(nèi)參，先每組都減去GAPDH CT，然后在減去所有組中的最大值及計(jì)算應(yīng)用2-??Ct。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 腎功能、內(nèi)皮素、血管緊張素、腎臟ROS表達(dá)水平在各組的變化

內(nèi)皮素在4h節(jié)點(diǎn)CMI、CMI+AMI、AMI均有顯著升高，并且CM、CM+AMI在24h仍然顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。AMI+CM組的4h內(nèi)皮素表達(dá)顯著高于CM組（P＜0.05)。(Fig1A) 血管緊張素在4h節(jié)點(diǎn)CMI、CMI+AMI、AMI均有顯著升高。AMI+CM血管緊張素在4h表達(dá)最高（P＜0.05）。隨后AMI+CM組血管緊張素表達(dá)在24h已下降。(Fig 1B)肌酐在4h時(shí)所有組均無(wú)顯著改變(P＞0.05)。除了對(duì)照組，其他組在24h時(shí)肌酐均顯著升高，其中AMI+CM組是肌酐升高最顯著的（P＜0.05），CM組肌酐水平和AMI組比較無(wú)顯著差異。(Fig 1C)與對(duì)照組比較，AMI、AMI+CM、CM組在4h時(shí)ROS表達(dá)顯著增高，并且持續(xù)升高至24h。AMI+CM組的ROS表達(dá)水平在24h顯著高于其他組(P＜0.05)。(Fig 1D)

2.2 腎動(dòng)脈血流速度在各組的變化

AMI+CM組的腎動(dòng)脈血流速度從0min～24小時(shí)均顯著低CM組(P＜0.05)。在剛開(kāi)始注射造影劑的2min內(nèi)，腎動(dòng)脈血流速度在CM組從1042.7±92.6mm/s 增加至1290±107.80 mm/s。AMI+CM組從792.80±36.19 mm/s 增加至 1043.39±75.58 mm/s。隨后腎動(dòng)脈血流速度下降至基線水平至24h(Fig 2A)。在注射造影劑前，通過(guò)超聲心動(dòng)圖評(píng)估各組的的室壁運(yùn)動(dòng)障礙?？梢园l(fā)現(xiàn)建立心肌梗死模型的大鼠的室壁運(yùn)動(dòng)顯著減弱，心臟超聲檢測(cè)LVEF，AMI+CM組和AMI組的LVEF顯著下降，和CM組和對(duì)照組比較顯著差異（P＜0.05），AMI和AMI+CM之間無(wú)顯著差異，CM和對(duì)照組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。(Fig 2B 2C)

2.3 造影劑在腎臟滯留各組比較

總體上造影劑注射后各組均有一定程度的造影劑的滯留。在CM組和AMI+CM組造影劑注射4h后，我們觀察到腎皮質(zhì)CT分別為124.85±15.37 and 65.06±7.13 HU，(兩組基線值分別為 46.48±2.9HU and 45.36±2.68 HU)。在造影劑注射12h后，AMI+CM和CM組的CT和基線比較無(wú)顯著差異。(FIG.3)

2.4 NF-κb and caspase-3 mRNA在各組表達(dá)情況

NF-kb因子表達(dá)升高與腎臟損傷有密切關(guān)聯(lián)，故我們通過(guò)real-time PCR方法檢測(cè)各組腎臟中NF-kb表達(dá)情況.結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，其余各組NF-kb.的表達(dá)均有顯著升高，4h時(shí)CM組，CM+AMI組基因表達(dá)顯著高于control組，并且仍然在24h持續(xù)。AMI組在24h也有所升高，但顯著低于CM+AMI組的表達(dá)（P＜0.05），CM+AMI組表達(dá)在24h也顯著高于CM組（P＜0.05）。(Fig4A)Caspase-3基因與凋亡和腎臟損害有一定關(guān)系。Caspase-3基因表達(dá)與control組相比，CM組，AMI+CM組和AMI組在4h也顯著升高。CM組和CM+AMI組仍然繼續(xù)升高至24h，而AMI組在24h則下降。在CM+AMI組，該基因的表達(dá)在4h和24h顯著顯高于CM組(P＜0.05)。(Fig 4B).

3.討論

本研究表明在急性心肌梗死狀態(tài)下，造影劑對(duì)腎臟的損害要比正常狀態(tài)下的大鼠更加嚴(yán)重。主要為心梗導(dǎo)致的血流動(dòng)力學(xué)變化，以及造影劑和心梗帶來(lái)的氧化應(yīng)激，從而引起的凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)基因水平的改變。

（1）血流動(dòng)力學(xué)改變。造影劑可以引起腎動(dòng)脈及腎內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)改變已經(jīng)被很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，這主要表現(xiàn)在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的血流下降[12-13]，和增加的腎內(nèi)血管的阻力。我們通過(guò)結(jié)扎前降支建立心肌梗死模型，并且是引起急性癥狀和血流動(dòng)力學(xué)改變較大的常見(jiàn)血管，所有大鼠在注射造影劑前檢測(cè)VRABF，開(kāi)始進(jìn)行造影劑注射，結(jié)果表明造影劑對(duì)腎動(dòng)脈的影響在CM和CM+AMI組兩者是無(wú)顯著影響的，所以我們認(rèn)為心肌梗死引起了腎動(dòng)脈的血流下降，進(jìn)一步引起了腎內(nèi)灌注不足，從本研究中發(fā)現(xiàn)ET-1在AMI+CM組一直都是處于最高，從4h開(kāi)始到24h仍然繼續(xù)升高。Ang-Ⅱ也是縮血管物質(zhì)，但主要作用于較大血管及動(dòng)脈血管，本實(shí)驗(yàn)中Ang-Ⅱ在AMI+CM組升高最顯著，也有文獻(xiàn)報(bào)道正常大鼠在注射造影劑后Ang-Ⅱ會(huì)有所升高[11，14]。通過(guò)CT掃描觀察造影劑在AMI+CM組和CM組腎臟的滯留，結(jié)果說(shuō)明造影劑在AMI+CM組滯留的時(shí)間更長(zhǎng)，這也與腎血流的下降和縮血管物質(zhì)的增多引起的微循環(huán)功能的障礙相互吻合。

（2）氧化應(yīng)激，NF-κb和CASPASE-3 基因升高。以往很多研究表明造影劑引起的腎臟損害，特別是腎小管的凋亡和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，在一些大規(guī)模的臨床試驗(yàn)中，抗氧化劑NAC被證明可以減少臨床造影劑腎病的發(fā)生[15]，本試驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)ROS產(chǎn)生最多的也是AMI+CM組，而AMI組高于control組說(shuō)明心肌梗死時(shí)本身就造成了腎臟ROS的增多，并且和CM組升高無(wú)顯著差異，可以認(rèn)為在心肌梗死后在注射造影劑前ROS就已經(jīng)升高，已經(jīng)改變了髓質(zhì)的氧平衡，從而增強(qiáng)了ROS這種途徑的損傷作用。ROS在凋亡中扮演了重要角色，許多實(shí)驗(yàn)表明ROS和凋亡密切相關(guān)，最后激活了Caspase-3[16]。Caspase-3是調(diào)節(jié)凋亡的最重要一個(gè)基因，許多實(shí)驗(yàn)都已經(jīng)證實(shí)在注射造影劑后該基因會(huì)升高[17-19]，我們實(shí)驗(yàn)同樣也證實(shí)其重要性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了在心肌梗死時(shí)Caspase-3腎臟表達(dá)升高并且和造影劑造成該基因表達(dá)上調(diào)相互增強(qiáng)是促進(jìn)凋亡的一個(gè)重要因素。NF-κb是一個(gè)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，有多重效應(yīng)，有文獻(xiàn)報(bào)道它與細(xì)胞凋亡有相關(guān)，可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[20-21]而有研究表明氧化應(yīng)激可以激活其表達(dá)，并且和造影劑對(duì)腎臟的損害有相關(guān)[22]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了該基因表達(dá)的增高，并且在AMI+CM組增高最顯著，在AMI組我們也發(fā)現(xiàn)了該基因表達(dá)增高，同樣也說(shuō)明了在心肌梗死時(shí)腎臟的ROS有所升高。在很多指標(biāo)如ET-1，Ang-Ⅱ，Caspast-3等在AMI組表達(dá)和在CM組相似，但這些改變?cè)贏MI組只造成了較少的凋亡比例，和輕微的腎臟病理學(xué)的改變，這些病理生理改變與CM組相比顯著減輕，這些結(jié)果表明造影劑對(duì)腎小管的損害作用是最主導(dǎo)的作用，心肌梗死狀態(tài)只是對(duì)造影劑作用起到一定強(qiáng)化。