羅 杰，唐 唯，李燦輝

（云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是全球四大糧食作物之一，廣泛分布于全球150 多個國家和地區(qū)。2015 年，中國啟動了馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略[1]，旨在推進把馬鈴薯加工成饅頭、面條、米粉等主食。生產(chǎn)上利用的絕大多數(shù)是四倍體栽培種[2]，四倍體種在遺傳行為上較為復(fù)雜。由于遺傳背景狹窄，基因庫貧乏，使得四倍體馬鈴薯在育種過程中性狀分離不明顯，導(dǎo)致選擇效率降低。并且，染色體的倍性水平不同等諸多原因，使得不能直接利用自然界中的二倍體種資源，這在很大程度上限制了馬鈴薯優(yōu)良品種的選育。若從四倍體馬鈴薯中獲得雙單倍體材料，就可以直接將其雙單倍體種與野生種進行雜交，以此可將野生種中的高干物質(zhì)、抗病性、抗蟲性等優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到普通栽培種中。

1 獲得單倍體的方法

單倍體誘導(dǎo)包括花藥培養(yǎng)、花粉培養(yǎng)、子房培養(yǎng)和孤雌生殖四大類。

1.1 花藥培養(yǎng)

花藥培養(yǎng)是在無菌條件下把發(fā)育到一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上，使花粉粒的發(fā)育程序發(fā)生改變，并誘導(dǎo)其分化，進行有絲分裂形成細胞團、愈傷組織，或分化成胚狀體，最后使其分化成完整植株的一種植物組織培養(yǎng)技術(shù)。利用馬鈴薯花藥培養(yǎng)首次獲得單倍體植株是在1973 年，Dunwell和Sunderland[3]以馬鈴薯品種‘Pentland Crow’進行花藥培養(yǎng)獲得再生植株。花藥培養(yǎng)是獲得單倍體最重要的方法，如今，在馬鈴薯的單倍體培養(yǎng)方面，許多科研人員也進行了廣泛的研究，并取得了一些重要的成果。

中國最早的馬鈴薯花藥培養(yǎng)研究始于1982年，戴朝曦[4]接種四倍體栽培種的花藥20 720 枚，獲得愈傷組織204塊、胚狀體24個、胚性細胞團3塊，最終分化獲得61 株小苗，但均未進行倍性鏡檢。同年，王玉娟等[5]同樣利用四倍體栽培種的馬鈴薯材料，接種花藥6 880 枚，獲得愈傷組織41塊，最終分化成苗共6 株，鏡檢后發(fā)現(xiàn)79-1、80-1、80-2、80-4 是雙單倍體，79-2 是混倍體，80-3未鑒定。1985年，朱明凱等[6]接種馬鈴薯花藥7 850 枚，獲得愈傷組織88 塊、胚狀體8 個，分化成苗共19株，鏡檢后發(fā)現(xiàn)其中有9株雙單倍體、5株四倍體、5 株混倍體。1990 年，王蒂等[7]利用四倍體、二倍體馬鈴薯材料進行花藥培養(yǎng)，最終有6 份材料產(chǎn)生了胚狀體并成苗；但關(guān)于接種花藥數(shù)、獲得的愈傷組織數(shù)等均未在文中提及。1993年，戴朝曦等[8]利用馬鈴薯雙單倍體材料，接種花藥1 850枚，獲得愈傷組織23塊、胚狀體28個，成苗24 株，能正常生長的植株都具有一倍體特征，無多倍化現(xiàn)象。同年，柳俊[9]對馬鈴薯花藥接種602 枚，獲得愈傷組織1 塊、胚狀體1 個，植株小苗12 株，鏡檢發(fā)現(xiàn)有8 株雙單倍體、2 株混倍體、2株四倍體。1993年，冉毅東和戴朝曦[10]利用四倍體、雙單倍體馬鈴薯材料，接種花藥3 040 枚，獲得愈傷組織19 塊、胚狀體127 個，植株小苗69株。1996年，冉毅東等[11]利用二倍體材料，接種花藥760 枚，獲得小苗35 株，鏡檢發(fā)現(xiàn)有1 株一倍體，33株二倍體，1株四倍體；關(guān)于獲得的愈傷組織數(shù)或胚狀體數(shù)未報道。2005年，盧翠華等[12]利用四倍體栽培種馬鈴薯，接種花藥21 640枚，最終只有2份材料分化出了小植株。2006年，梁彥濤等[13]接種花藥11 200 枚，獲得愈傷組織2 205 塊、胚狀體171 個、植株小苗45 株；鏡檢發(fā)現(xiàn)有43 株雙單倍體、2株四倍體。2007年，盧翠華等[14]利用四倍體栽培種馬鈴薯，接種花藥1 400 枚，獲得愈傷組織74 塊、胚狀體126 個、植株小苗45 株、鏡檢發(fā)現(xiàn)有41 株雙單倍體。同年，陳寶輝等[15]利用四倍體栽培種馬鈴薯，接種花藥7 762枚，獲得愈傷組織186塊、胚狀體65個，植株小苗10株，鏡檢發(fā)現(xiàn)有9株二倍體、1株四倍體。2008年，李鳳云等[16]接種花藥43 200 枚，最終獲得16 株小苗，鏡檢發(fā)現(xiàn)有15株雙單倍體、1株四倍體。2008年，王梓全等[17]進行馬鈴薯花藥培養(yǎng)，最終獲得8 株小苗，其中6株單倍體、2株四倍體；但接種花藥數(shù)、獲得愈傷組織數(shù)等均未報道。同年，越戀和何鳳發(fā)[18]利用四倍體栽培種馬鈴薯進行花藥培養(yǎng)，最終獲得37 株小苗，其中有28株單倍體、9株四倍體；接種花藥數(shù)、獲得愈傷組織數(shù)等也均未報道。2009 年，盧翠華等[19]利用四倍體栽培種，接種花藥3 670 枚，獲得愈傷組織241塊，植株小苗62株，其中雙單倍體小苗50 株、四倍體12 株。同年，李霞等[20]利用二倍體栽培種材料，接種花藥數(shù)5 544 枚，獲得愈傷組織和胚狀體共80 塊，是否獲得成苗植株未報道。2010年，趙欣等[21]接種花藥3 520枚，獲得愈傷組織94塊，植株小苗23株，其中15株雙單倍體、3株三倍體、5株四倍體。2011年，李文霞等[22]利用二倍體栽培種馬鈴薯材料，接種花藥2 160枚，獲得愈傷組織55塊，是否獲得植株小苗未報道。2012年，李文霞等[23]利用二倍體栽培種，接種花藥3 290 枚，獲得愈傷組織215 塊，植株小苗94 株。2014 年，賀苗苗[24,25]利用四倍體栽培種馬鈴薯材料，接種花藥9 990 枚，獲得愈傷組織938 塊，其中‘青薯2 號’、‘高原4 號’、‘青05-12-6’分化出了小植株；另外還接種了花藥4 800 枚，但未說明取材品種，最終獲得愈傷組織392塊。

1.2 花粉培養(yǎng)

花粉培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)類似，將花藥在無菌條件下接種到人工液體培養(yǎng)基中進行震蕩，過濾出花粉培養(yǎng)成完整植株。花粉培養(yǎng)技術(shù)在創(chuàng)建之時只是為了除去花藥培養(yǎng)時花藥壁和絨氈層組織的干擾，以達到直接研究小孢子胚胎發(fā)生機制的目的。人工誘導(dǎo)被子植物產(chǎn)生胚狀體和幼苗植株的首次報道是在1964年[26]。從嚴格意義上來說，花粉培養(yǎng)與單細胞培養(yǎng)類似，但花粉培養(yǎng)可避免花藥壁形成的植株混雜。

中國最早的相關(guān)報道始于1988 年，高秀云[27]接種了9 369枚花藥，從中取得了4 353個小孢子進行培養(yǎng)，最終獲得愈傷組織50 塊、胚狀體10 個、胚性細胞團4 塊，植株小苗共4 株，其中3 株雙單倍體、1株四倍體。1990年，左秋仙等[28]利用四倍體栽培種進行花粉培養(yǎng)，但只比較了不同處理下的花粉萌發(fā)率，是否獲得愈傷組織、胚狀體和小苗等均未報道。2001 年，張峰等[29]利用四倍體栽培種、雙單倍體材料，接種小孢子2 400 個以上，同樣只比較了不同處理下花粉的萌發(fā)率。2005 年，吳旺澤等[30]利用四倍體栽培種馬鈴薯，接種花藥1 501枚，從中得到小孢子3 692 個，最終萌發(fā)的小孢子數(shù)有2 182 個，同時也比較了不同處理下的花粉萌發(fā)率；是否獲得愈傷組織、胚狀體、植株小苗以及數(shù)量均未有報道。2009年，滕長才和張永成[31]在不同處理下獲得了8株小苗。2009年，楊甲鎖等[32]利用四倍體栽培種馬鈴薯進行花粉培養(yǎng)，也只是比較了不同處理下小孢子的萌發(fā)率和破碎率。同年，吳旺澤等[33]利用四倍體栽培種馬鈴薯，從接種的6 555枚花藥中獲得花粉并培養(yǎng)獲得11個胚狀體。

1.3 孤雌生殖

孤雌生殖是指生長到一定時期的母本花蕾去雄，進行人工授粉后自然生長結(jié)實，在無菌條件下將果實中的種子接種在人工培養(yǎng)基上，使其分化成完整植株的過程。最早的孤雌生殖大多為自然產(chǎn)生的，并且發(fā)生的幾率非常低，現(xiàn)今可用人工誘導(dǎo)孤雌生殖。1957 年，Hougas 和Peloquin[34]首次從四倍體品種‘Katahdin’與‘Phureja’的雜交后代中得到了一株雙單倍體。1964 年，Hougas 等[35]發(fā)現(xiàn)，要提高雙單倍體產(chǎn)生的頻率就要選擇合適的母本材料和優(yōu)良的授粉者。

中國研究者利用孤雌生殖的方法也獲得了一些馬鈴薯雙單倍體材料。1987 年，肖增寬等[36]利用1 個父本材料和9 個母本材料共授粉花朵4 930朵，獲得漿果262 個、種子1 295 粒，其中無胚斑的種子有922 粒，最終誘導(dǎo)出雙單倍體植株148株。1989 年，張景濤等[37]利用1 個父本材料和1 個母本材料，共獲得漿果46 個、種子3 442 粒，其中有24 份為四倍體。1996 年，鞏秀峰等[38]利用6份父本材料和40 份母本材料，獲得漿果534 個、種子4 363 粒，但并未報道最終獲得的雙單倍體植株數(shù)量。同年，龐萬福等[39]利用3 份父本材料和11 份母本材料，授粉花朵2 340 朵，獲得漿果348個、種子2 797 粒，其中無胚斑標記的種子1 468粒，最終得到了63 株雙單倍體。1997 年，張希近等[40]利用11 份父本材料和4 份母本材料，獲得無胚斑標記的種子2 180 粒，最終得到125 株雙單倍體。2006 年，李先平等[41]利用9 份父本材料和13份母本材料，授粉花朵3 226朵，得到漿果596個、種子44 131 粒，其中無胚斑標記的種子共3 789粒，最終得到27株雙單倍體。

1.4 子房培養(yǎng)

子房培養(yǎng)與花藥培養(yǎng)類似，是指在無菌條件下將生長到一定時期未受精的子房切下培養(yǎng)成完整植株的過程。對于雄性不育的品種而言，未受精子房誘導(dǎo)雙單倍體的效果優(yōu)于花藥培養(yǎng)，并且由子房誘導(dǎo)成愈傷組織較容易。馬鈴薯花藥、花粉培養(yǎng)及孤雌生殖獲得雙單倍體的研究頗多，但未受精子房誘導(dǎo)雙單倍體的研究卻很少。1988年，陶自榮等[42]利用四倍體栽培種馬鈴薯，接種子房548 個，獲得愈傷組織299 個，最終培育出小苗2 株，且2 株均為雙單倍體。2011 年，張鳳軍和張永成[43]利用四倍體栽培種馬鈴薯，接種子房6 860 個，獲得愈傷組織2 854 個，最終培育出小苗4株，其中1株死亡，另3株為雙單倍體。

2 單倍體誘導(dǎo)現(xiàn)狀及存在問題

在馬鈴薯單倍體誘導(dǎo)方面，研究最多并成功獲得小植株的是花藥培養(yǎng)。雖然花粉培養(yǎng)較孤雌生殖和子房培養(yǎng)的研究多一些，但大部分研究者的目的不是為了獲得單倍體植株，而是為了研究在不同處理下的花粉萌發(fā)率。國內(nèi)關(guān)于花藥培養(yǎng)較完善的早期研究是在1982年，戴朝曦[4]采用了5種不同的培養(yǎng)基，共接種花藥20 720枚，誘導(dǎo)出愈傷組織204塊，胚狀體24個，胚性細胞團3塊，共分化出小植株61株，但文中并未說明最終獲得的植株倍性及數(shù)量。從研究的時間點來看，除了花藥培養(yǎng)，其余幾類研究都較少，特別是子房培養(yǎng)，目前只有2項研究。

多數(shù)研究者選擇花藥培養(yǎng)獲得小植株大多基于以下原因：（1）取材：花藥獲取較容易且數(shù)量大，一定程度上提高了成功率。在采摘單核靠邊期的花蕾[44]預(yù)處理后經(jīng)過剝離即可得到花藥，而要獲得花粉卻要預(yù)培養(yǎng)花藥后獲得有效小孢子才能進行后續(xù)試驗；雖然子房的獲取與花藥獲取方法類似，但是在相同條件下，能獲得的子房數(shù)量卻遠小于花藥數(shù)；孤雌生殖誘導(dǎo)的工作量大而繁瑣，必須要種植供試材料及授粉者材料經(jīng)人工授粉后才能進行后續(xù)工作。（2）培養(yǎng)基添加物：所有研究的試驗方法都大致相同，不同的是培養(yǎng)基中各類添加物及用量。例如，糖、瓊脂、活性炭、馬鈴薯提取液、椰子汁、激素等的不同選擇及用量的微小變化都會影響培養(yǎng)過程中獲得愈傷組織、胚性細胞團和胚狀體的數(shù)量。（3）培養(yǎng)條件：光照、pH、溫度和濕度等也會影響最終的成功率。（4）供體基因型：不同材料的基因型也同樣影響著試驗的成功率，有研究者專門做了不同基因型馬鈴薯的花藥培養(yǎng)，基因型的不同使最終花藥培養(yǎng)成功的概率不同，說明基因型是影響試驗成功率的因素之一。綜上所述，只有取材時期、培養(yǎng)基添加物、材料的基因型、培養(yǎng)條件等因素都非常合適時，才能大大提高培養(yǎng)的成功率，并獲得完整植株。

在各類研究中，有極大一部分試驗都獲得了單倍體或雙單倍體的小植株，但是獲得小植株后的用途或相關(guān)研究并未有報道。雖然單倍體植株比較弱小，并且只含有雙親中一方的遺傳物質(zhì)，但其仍然能正常生長，且具有生長發(fā)育、遺傳變異的功能。這對所獲單倍體抗病蟲害、產(chǎn)量、重要農(nóng)藝性狀等表型的研究都非常有意義。

3 單倍體誘導(dǎo)的展望

近些年，馬鈴薯育種規(guī)模不斷增加，根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）2014 年統(tǒng)計的數(shù)據(jù)顯示，中國馬鈴薯的種植面積已達564.7 萬hm2[45]，是世界上馬鈴薯生產(chǎn)大國。2015 年中國在啟動馬鈴薯主食產(chǎn)品及產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略的同時，還加快了中國特色馬鈴薯產(chǎn)品的發(fā)展，為降低其成本、促進其成為主食產(chǎn)品等起到了推動作用[46]。馬鈴薯單倍體誘導(dǎo)的方法都大同小異，想要成功獲得單倍體小植株，除了前文提到的很多困難需要解決以外，成功誘導(dǎo)出單倍體小苗本身還存在一定的偶然性，且后代的變異機制不明確，該領(lǐng)域也無重大創(chuàng)新成果，因此單倍體誘導(dǎo)及單倍體育種在近些年都發(fā)展緩慢。但馬鈴薯單倍體在種質(zhì)資源利用、分子育種、優(yōu)良品種選育以及全基因組拼接等方面具有重大意義，利用馬鈴薯單倍體或雙單倍體植株有望加速育種過程、改良馬鈴薯優(yōu)良性狀并提高其經(jīng)濟實用價值。