李俊霞 藺曉月 孫圣福 陳靜 田夫林 李云崗 張?jiān)?/p>
(山東省動物疫病預(yù)防與控制中心 250031)
乳酸菌是一種革蘭氏陽性菌,可以發(fā)酵碳水化合物生成大量的乳酸,具有雙歧桿菌、乳酸桿菌、乳酸球菌等十幾個屬。在人體、大部分動物腸道中,乳酸菌是非常常見的一種細(xì)菌。乳酸菌沒有致病性,被應(yīng)用于食品工業(yè)等領(lǐng)域中,是一種公認(rèn)的安全級微生物。雙歧菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬等因與益生作用具有密切關(guān)系,受到人們的廣泛重視。乳酸菌可在黏膜部位、生殖系統(tǒng)、泌尿、胃腸道等中黏附存活,并且沒有病原性,利用乳酸菌的這一特點(diǎn)進(jìn)行了大量的活菌口服疫苗研究,并且受到廣泛關(guān)注。
口服疫苗利用胃腸黏膜來遞呈抗原,經(jīng)過不同的免疫通路,能產(chǎn)生和常規(guī)注射相似的免疫反應(yīng)。在醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)快速發(fā)展的背景下,有關(guān)口服疫苗在黏膜抗原遞呈的研究有了突破性的發(fā)展,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答與免疫耐受。
近年來,在研究疫苗傳遞系統(tǒng)方面,研究人員迫切找到一種傳遞載體,可以在機(jī)體內(nèi)長時間存在、不會對機(jī)體產(chǎn)生損害,并且可以產(chǎn)生持續(xù)免疫力。作為原核表達(dá)系統(tǒng)中的一種,在表達(dá)外源基因方面乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)具有以下幾個特點(diǎn):(1)一些菌種自身攜帶大量染色體外因子,比較容易發(fā)展新的表達(dá)載體系統(tǒng);(2)培養(yǎng)簡便,遺傳操作方法效率高、已經(jīng)較為成熟,具有良好的重復(fù)率;(3)乳酸菌是食品級的細(xì)菌,能構(gòu)建食品級的表達(dá)系統(tǒng)和基因克隆,促進(jìn)基因工程相關(guān)產(chǎn)品安全性的提高;(4)本底表達(dá)水平比較低,表達(dá)量相對較高,純化簡單;(5)該系統(tǒng)的啟動子系統(tǒng)能進(jìn)行高度調(diào)控,且能表達(dá)毒素基因;(6)在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外均能表達(dá),并且可以分泌到細(xì)胞外;(7)乳酸菌無內(nèi)毒素、比較安全,其表達(dá)的外源蛋白不用進(jìn)行純化便能和菌體一起服用;(8)乳桿菌等菌株對機(jī)體黏膜有非常強(qiáng)的黏附作用,乳酸菌表達(dá)與治療或免疫作用的蛋白可以源源不斷在黏膜處生產(chǎn),持續(xù)向機(jī)體釋放目的抗原蛋白,能有效引起機(jī)體的免疫應(yīng)答和免疫耐受,提高對人、畜的免疫作用,是一種極具廣泛應(yīng)用前景的、理想的抗原呈遞載體。
乳酸菌口服疫苗是以乳酸菌作為載體菌,利用基因工程技術(shù)重組病毒、細(xì)菌或寄生蟲等病原基因,構(gòu)建能表達(dá)外源抗原或攜帶外源DNA 疫苗的重組乳酸菌。這些重組菌能通過口服或滴鼻的途徑將抗原傳遞至宿主黏膜系統(tǒng),進(jìn)而在黏膜水平刺激免疫宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)。其可同時激發(fā)機(jī)體體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫應(yīng)答,且免疫過程和病原感染一致,能在黏膜水平預(yù)防病原感染。重組乳酸菌不僅具有疾病預(yù)防作用,對已發(fā)生的病毒感染同時具有一定的治療和抑制作用。下文主要闡述了乳酸菌在幾種常見豬病預(yù)防中的研究和應(yīng)用。
豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病,主要特征是引起豬的食欲不振、嘔吐、腹瀉,不同日齡的豬發(fā)病時的臨床癥狀不盡相同,發(fā)病仔豬多數(shù)會因脫水導(dǎo)致死亡[1]。當(dāng)前豬流行性腹瀉發(fā)病率居高不下,臨床癥狀也愈來愈復(fù)雜,時常出現(xiàn)混合感染的現(xiàn)象,給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重危害,因而其疫苗的研制備受廣大研究者重視。張?jiān)聵?gòu)建攜帶PEDV S 基因和復(fù)制子基因Rep.8014的 pRc/CMV2-S1-Rep.8014 和 pRc/CMV2-S2-Rep.8014 重組質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)入乳酸菌中,得到重組乳酸桿菌疫苗。通過多組動物實(shí)驗(yàn)的口服免疫,發(fā)現(xiàn)重組乳酸桿菌口服疫苗不僅能激發(fā)小鼠的體液和細(xì)胞免疫,而且能刺激腸道局部免疫應(yīng)答[2]。另外,有研究從健康豬體內(nèi)分離篩選thyA 基因缺陷型乳酸桿菌,構(gòu)建含有PEDV 主要保護(hù)性抗原基因的以thyA 基因?yàn)檫x擇壓力的非抗性乳酸桿菌表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入乳酸桿菌,制備基因工程乳酸桿菌口服疫苗[3]。
豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of pigs,TGE)是一種急性、高接觸性腸道傳染病,由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of pigs,TGEV)引起,病豬臨床癥狀為嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水,多與豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒和致病性大腸桿菌等病院混合感染,一般不易診斷鑒別[4]。各種年齡及品種的豬對TGEV 均容易感染,特別是2 周齡以下的仔豬感染后死亡率高達(dá)100%。豬傳染性胃腸炎呈世界性分布,給各國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。黃海楠等構(gòu)建含TGEV S 基因AD 片段的載體,并轉(zhuǎn)入乳酸桿菌中表達(dá),制備乳酸菌口服疫苗,免疫小鼠,經(jīng)細(xì)胞免疫和體液免疫檢測,結(jié)果表明,這一乳酸桿菌口服疫苗具有比較好的免疫效果[5]。
豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus,PRV)是呼腸孤病毒科,輪狀病毒屬,是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一,該病在世界范圍內(nèi)分布,其感染引發(fā)的腹瀉已發(fā)展成為一種世界性的疾病,給世界各地畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的損失。1~4 周齡仔豬的發(fā)病率超過80%,死亡率可達(dá)20%。研究者們分別構(gòu)建含有豬輪狀病毒VP4、VP6、VP7 蛋白的重組乳酸菌,用其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的血清和黏膜抗體,從而促進(jìn)小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫[6-8]。
豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬,臨床癥狀主要是引起初孕母豬的繁殖障礙,導(dǎo)致仔豬皮膚炎癥和腸炎性腹瀉。這種疾病在臨床表現(xiàn)和病理特點(diǎn)上不盡相同[9]。目前,PPV 與其他病毒混合感染發(fā)生較多,是導(dǎo)致很多疾病綜合征的病原之一。徐義剛等構(gòu)建的分泌型重組豬細(xì)小病毒VP2 基因的重組干酪乳桿菌免疫小鼠能產(chǎn)生明顯的抗PPV 抗體水平,表明分泌型的重組乳酸菌作為口服疫苗載體具有更好的免疫原性[10]。另外,王相清等構(gòu)建了重組大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)和豬細(xì)小病毒VP2 蛋白的干酪乳桿菌細(xì)胞表面表達(dá)和分泌表達(dá)系統(tǒng),其試驗(yàn)結(jié)果表明,VP2 蛋白和LTB 共表達(dá)時,可增強(qiáng)黏膜免疫反應(yīng),其中LTB 具有較好的免疫原性、抗原性和佐劑特性,這一研究為研制新型、有效的豬細(xì)小病毒口服疫苗奠定了基礎(chǔ)[11]。
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,F(xiàn)MDV)引起的一種烈性、急性動物傳染病,其臨床癥狀表現(xiàn)為口腔黏膜、蹄部及乳房皮膚發(fā)生水皰和糜爛,具有很快的傳播速度,并且影響范圍較大,給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來非常大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。隨著畜牧業(yè)養(yǎng)殖規(guī)?;潭鹊奶岣?,口蹄疫對畜牧養(yǎng)殖業(yè)的危害越來越大,其預(yù)防難度不斷增大,傳統(tǒng)預(yù)防措施已明顯不足,這對新的防控技術(shù),尤其是對安全有效的新型疫苗的需求日漸迫切。李云崗等構(gòu)建FMDV VP1 乳酸桿菌口服疫苗,并用其免疫仔豬,檢測結(jié)果顯示,這一疫苗能產(chǎn)生比較高的抗體效價(jià),能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫[13]。王淼等構(gòu)建的重組乳酸桿菌免疫豚鼠的結(jié)果也顯示,乳酸菌口服疫苗可以增強(qiáng)動物的免疫功能,預(yù)防FMDV 的感染[14]。
豬鏈球菌(Streptococcus suis)根據(jù)菌體莢膜抗原特性的差別,可以分為35個血清型,其中豬鏈球菌2 型感染時,致病性較強(qiáng),傳播速度較快,并且其致死率較高[15]。豬鏈球菌病流行沒有明顯的季節(jié)性,一年四季均可發(fā)生,因此,為控制豬鏈球菌病的發(fā)生應(yīng)以預(yù)防為主。張秋香等將豬鏈球菌毒力因子EF和MRP 基因連接在組成型啟動子P59 和信號肽Usp45 下游,構(gòu)建乳酸菌表達(dá)載體,使其在干酪乳桿菌中表達(dá),制備口服疫苗[16]。用這種口服疫苗飼喂小鼠發(fā)現(xiàn),這種重組乳桿菌可以刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體,這一研究為豬鏈球菌病乳酸菌口服疫苗的研制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
首先,乳酸菌作為口服疫苗載體雖然具有很多優(yōu)點(diǎn),但在乳酸菌疫苗市場化之前仍面臨很多問題。目前可用于構(gòu)建疫苗的載體菌株僅限于乳酸乳球菌和乳酸桿菌屬中的幾個菌株,表達(dá)的抗原蛋白僅限于幾種,構(gòu)建成功的疫苗也不多,開發(fā)更多、更有效的疫苗載體株,構(gòu)建更多、更有效的疫苗是今后的一個研究方向。第二,對目前構(gòu)建的疫苗效果的研究僅限于動物試驗(yàn)階段和體外試驗(yàn)階段,疫苗的臨床應(yīng)用還需一段時間。第三,口服免疫是益生菌疫苗的一個重要優(yōu)勢,這要求疫苗菌株要能經(jīng)受人體胃腸道胃酸和膽鹽的作用。而且,工程菌在體內(nèi)可以存活多久及乳酸桿菌攜帶抗原表達(dá)的效果有待確定。另外,動物及人體腸道的微生態(tài)系統(tǒng)非常復(fù)雜,疫苗菌株與其他微生物間是否相互影響,這種影響是否會削弱疫苗的免疫效果是疫苗臨床應(yīng)用中應(yīng)考慮的問題。