李俊霞 藺曉月 孫圣福 陳靜 田夫林 李云崗 張?jiān)?/p>

（山東省動物疫病預(yù)防與控制中心 250031）

乳酸菌是一種革蘭氏陽性菌，可以發(fā)酵碳水化合物生成大量的乳酸，具有雙歧桿菌、乳酸桿菌、乳酸球菌等十幾個屬。在人體、大部分動物腸道中，乳酸菌是非常常見的一種細(xì)菌。乳酸菌沒有致病性，被應(yīng)用于食品工業(yè)等領(lǐng)域中，是一種公認(rèn)的安全級微生物。雙歧菌屬、腸球菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬等因與益生作用具有密切關(guān)系，受到人們的廣泛重視。乳酸菌可在黏膜部位、生殖系統(tǒng)、泌尿、胃腸道等中黏附存活，并且沒有病原性，利用乳酸菌的這一特點(diǎn)進(jìn)行了大量的活菌口服疫苗研究，并且受到廣泛關(guān)注。

口服疫苗利用胃腸黏膜來遞呈抗原，經(jīng)過不同的免疫通路，能產(chǎn)生和常規(guī)注射相似的免疫反應(yīng)。在醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)快速發(fā)展的背景下，有關(guān)口服疫苗在黏膜抗原遞呈的研究有了突破性的發(fā)展，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答與免疫耐受。

1 乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)

近年來，在研究疫苗傳遞系統(tǒng)方面，研究人員迫切找到一種傳遞載體，可以在機(jī)體內(nèi)長時間存在、不會對機(jī)體產(chǎn)生損害，并且可以產(chǎn)生持續(xù)免疫力。作為原核表達(dá)系統(tǒng)中的一種，在表達(dá)外源基因方面乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)具有以下幾個特點(diǎn)：（1）一些菌種自身攜帶大量染色體外因子，比較容易發(fā)展新的表達(dá)載體系統(tǒng)；（2）培養(yǎng)簡便，遺傳操作方法效率高、已經(jīng)較為成熟，具有良好的重復(fù)率；（3）乳酸菌是食品級的細(xì)菌，能構(gòu)建食品級的表達(dá)系統(tǒng)和基因克隆，促進(jìn)基因工程相關(guān)產(chǎn)品安全性的提高；（4）本底表達(dá)水平比較低，表達(dá)量相對較高，純化簡單；（5）該系統(tǒng)的啟動子系統(tǒng)能進(jìn)行高度調(diào)控，且能表達(dá)毒素基因；（6）在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外均能表達(dá)，并且可以分泌到細(xì)胞外；（7）乳酸菌無內(nèi)毒素、比較安全，其表達(dá)的外源蛋白不用進(jìn)行純化便能和菌體一起服用；（8）乳桿菌等菌株對機(jī)體黏膜有非常強(qiáng)的黏附作用，乳酸菌表達(dá)與治療或免疫作用的蛋白可以源源不斷在黏膜處生產(chǎn)，持續(xù)向機(jī)體釋放目的抗原蛋白，能有效引起機(jī)體的免疫應(yīng)答和免疫耐受，提高對人、畜的免疫作用，是一種極具廣泛應(yīng)用前景的、理想的抗原呈遞載體。

2 乳酸菌口服疫苗的作用機(jī)理

乳酸菌口服疫苗是以乳酸菌作為載體菌，利用基因工程技術(shù)重組病毒、細(xì)菌或寄生蟲等病原基因，構(gòu)建能表達(dá)外源抗原或攜帶外源DNA 疫苗的重組乳酸菌。這些重組菌能通過口服或滴鼻的途徑將抗原傳遞至宿主黏膜系統(tǒng)，進(jìn)而在黏膜水平刺激免疫宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)。其可同時激發(fā)機(jī)體體液免疫、細(xì)胞免疫和黏膜免疫應(yīng)答，且免疫過程和病原感染一致，能在黏膜水平預(yù)防病原感染。重組乳酸菌不僅具有疾病預(yù)防作用，對已發(fā)生的病毒感染同時具有一定的治療和抑制作用。下文主要闡述了乳酸菌在幾種常見豬病預(yù)防中的研究和應(yīng)用。

3 乳酸菌口服疫苗在豬病防治中的應(yīng)用

3.1 豬流行性腹瀉

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，主要特征是引起豬的食欲不振、嘔吐、腹瀉，不同日齡的豬發(fā)病時的臨床癥狀不盡相同，發(fā)病仔豬多數(shù)會因脫水導(dǎo)致死亡[1]。當(dāng)前豬流行性腹瀉發(fā)病率居高不下，臨床癥狀也愈來愈復(fù)雜，時常出現(xiàn)混合感染的現(xiàn)象，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重危害，因而其疫苗的研制備受廣大研究者重視。張?jiān)聵?gòu)建攜帶PEDV S 基因和復(fù)制子基因Rep.8014的 pRc/CMV2-S1-Rep.8014 和 pRc/CMV2-S2-Rep.8014 重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入乳酸菌中，得到重組乳酸桿菌疫苗。通過多組動物實(shí)驗(yàn)的口服免疫，發(fā)現(xiàn)重組乳酸桿菌口服疫苗不僅能激發(fā)小鼠的體液和細(xì)胞免疫，而且能刺激腸道局部免疫應(yīng)答[2]。另外，有研究從健康豬體內(nèi)分離篩選thyA 基因缺陷型乳酸桿菌，構(gòu)建含有PEDV 主要保護(hù)性抗原基因的以thyA 基因?yàn)檫x擇壓力的非抗性乳酸桿菌表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入乳酸桿菌，制備基因工程乳酸桿菌口服疫苗[3]。

3.2 豬傳染性胃腸炎

豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis of pigs，TGE）是一種急性、高接觸性腸道傳染病，由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of pigs，TGEV）引起，病豬臨床癥狀為嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水，多與豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒和致病性大腸桿菌等病院混合感染，一般不易診斷鑒別[4]。各種年齡及品種的豬對TGEV 均容易感染，特別是2 周齡以下的仔豬感染后死亡率高達(dá)100%。豬傳染性胃腸炎呈世界性分布，給各國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。黃海楠等構(gòu)建含TGEV S 基因AD 片段的載體，并轉(zhuǎn)入乳酸桿菌中表達(dá)，制備乳酸菌口服疫苗，免疫小鼠，經(jīng)細(xì)胞免疫和體液免疫檢測，結(jié)果表明，這一乳酸桿菌口服疫苗具有比較好的免疫效果[5]。

3.3 豬輪狀病毒病

豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus，PRV）是呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原之一，該病在世界范圍內(nèi)分布，其感染引發(fā)的腹瀉已發(fā)展成為一種世界性的疾病，給世界各地畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的損失。1～4 周齡仔豬的發(fā)病率超過80%，死亡率可達(dá)20%。研究者們分別構(gòu)建含有豬輪狀病毒VP4、VP6、VP7 蛋白的重組乳酸菌，用其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的血清和黏膜抗體，從而促進(jìn)小鼠細(xì)胞免疫和體液免疫[6-8]。

3.4 豬細(xì)小病毒病

豬細(xì)小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，臨床癥狀主要是引起初孕母豬的繁殖障礙，導(dǎo)致仔豬皮膚炎癥和腸炎性腹瀉。這種疾病在臨床表現(xiàn)和病理特點(diǎn)上不盡相同[9]。目前，PPV 與其他病毒混合感染發(fā)生較多，是導(dǎo)致很多疾病綜合征的病原之一。徐義剛等構(gòu)建的分泌型重組豬細(xì)小病毒VP2 基因的重組干酪乳桿菌免疫小鼠能產(chǎn)生明顯的抗PPV 抗體水平，表明分泌型的重組乳酸菌作為口服疫苗載體具有更好的免疫原性[10]。另外，王相清等構(gòu)建了重組大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位（LTB）和豬細(xì)小病毒VP2 蛋白的干酪乳桿菌細(xì)胞表面表達(dá)和分泌表達(dá)系統(tǒng)，其試驗(yàn)結(jié)果表明，VP2 蛋白和LTB 共表達(dá)時，可增強(qiáng)黏膜免疫反應(yīng)，其中LTB 具有較好的免疫原性、抗原性和佐劑特性，這一研究為研制新型、有效的豬細(xì)小病毒口服疫苗奠定了基礎(chǔ)[11]。

3.5 口蹄疫

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）引起的一種烈性、急性動物傳染病，其臨床癥狀表現(xiàn)為口腔黏膜、蹄部及乳房皮膚發(fā)生水皰和糜爛，具有很快的傳播速度，并且影響范圍較大，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來非常大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。隨著畜牧業(yè)養(yǎng)殖規(guī)?；潭鹊奶岣?，口蹄疫對畜牧養(yǎng)殖業(yè)的危害越來越大，其預(yù)防難度不斷增大，傳統(tǒng)預(yù)防措施已明顯不足，這對新的防控技術(shù)，尤其是對安全有效的新型疫苗的需求日漸迫切。李云崗等構(gòu)建FMDV VP1 乳酸桿菌口服疫苗，并用其免疫仔豬，檢測結(jié)果顯示，這一疫苗能產(chǎn)生比較高的抗體效價(jià)，能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫[13]。王淼等構(gòu)建的重組乳酸桿菌免疫豚鼠的結(jié)果也顯示，乳酸菌口服疫苗可以增強(qiáng)動物的免疫功能，預(yù)防FMDV 的感染[14]。

3.6 豬鏈球菌病

豬鏈球菌（Streptococcus suis）根據(jù)菌體莢膜抗原特性的差別，可以分為35個血清型，其中豬鏈球菌2 型感染時，致病性較強(qiáng)，傳播速度較快，并且其致死率較高[15]。豬鏈球菌病流行沒有明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，因此，為控制豬鏈球菌病的發(fā)生應(yīng)以預(yù)防為主。張秋香等將豬鏈球菌毒力因子EF和MRP 基因連接在組成型啟動子P59 和信號肽Usp45 下游，構(gòu)建乳酸菌表達(dá)載體，使其在干酪乳桿菌中表達(dá)，制備口服疫苗[16]。用這種口服疫苗飼喂小鼠發(fā)現(xiàn)，這種重組乳桿菌可以刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體，這一研究為豬鏈球菌病乳酸菌口服疫苗的研制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4 乳酸菌口服疫苗的問題與展望

首先，乳酸菌作為口服疫苗載體雖然具有很多優(yōu)點(diǎn)，但在乳酸菌疫苗市場化之前仍面臨很多問題。目前可用于構(gòu)建疫苗的載體菌株僅限于乳酸乳球菌和乳酸桿菌屬中的幾個菌株，表達(dá)的抗原蛋白僅限于幾種，構(gòu)建成功的疫苗也不多，開發(fā)更多、更有效的疫苗載體株，構(gòu)建更多、更有效的疫苗是今后的一個研究方向。第二，對目前構(gòu)建的疫苗效果的研究僅限于動物試驗(yàn)階段和體外試驗(yàn)階段，疫苗的臨床應(yīng)用還需一段時間。第三，口服免疫是益生菌疫苗的一個重要優(yōu)勢，這要求疫苗菌株要能經(jīng)受人體胃腸道胃酸和膽鹽的作用。而且，工程菌在體內(nèi)可以存活多久及乳酸桿菌攜帶抗原表達(dá)的效果有待確定。另外，動物及人體腸道的微生態(tài)系統(tǒng)非常復(fù)雜，疫苗菌株與其他微生物間是否相互影響，這種影響是否會削弱疫苗的免疫效果是疫苗臨床應(yīng)用中應(yīng)考慮的問題。