王媛媛，陶娌娜，宋燕青，李 楠

（吉林大學第一醫(yī)院藥學部，吉林 長春 130021）

缺血性腦卒中的發(fā)病機制為腦血流供應障礙造成大腦缺血缺氧［1］，隨著生物學技術及影像學的發(fā)展，多數(shù)證據(jù)支持其與氧自由基產(chǎn)生過多及消耗不足、缺血缺氧的大腦環(huán)境造成神經(jīng)細胞壞死與凋亡、免疫答應與炎性反應失衡等密切相關［2-4］。丹參是唇形科Labiatae多年生草本植物，最初被收載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有很高的藥用價值，味苦，性微寒，具有活血化瘀、祛瘀止痛、化癰清心的功效［5］。丹參酮（tanshinone）是丹參的脂溶性化合物的主要成分，其中丹參酮ⅡA（TanshinoneⅡA，Tan ⅡA）在丹參酮活性成分中含量最高，其通過抑制氧化應激反應、減輕炎性反應和抑制細胞凋亡等途徑發(fā)揮藥理作用，具有多靶點、多層次、多環(huán)節(jié)的腦保護功效［6-8］。在此對丹參酮ⅡA對腦缺血保護的作用機制的研究進行綜述。

1 抑制細胞凋亡

1.1 概述

缺血性腦卒中是由腦血流的突然減小或完全中斷造成腦組織缺氧缺糖，繼而引發(fā)一系列級聯(lián)反應造成的。早期腦組織缺血表現(xiàn)為中央缺血區(qū)域的神經(jīng)細胞呈不可逆性壞死，后期表現(xiàn)為缺血半暗帶細胞凋亡［9］。細胞凋亡是程序式過程，丹參酮ⅡA可通過抑制神經(jīng)細胞凋亡而保護腦細胞，以及縮小梗死區(qū)域。

1.2 抑制凋亡誘導因子表達

抑制Caspase-3表達：半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（Caspases）以無活性的結(jié)構(gòu)酶原的形式廣泛存在于細胞中。目前，已知14種哺乳動物的Caspases中，約有8種被認為參與著細胞凋亡的過程，其中最關鍵的凋亡蛋白酶被認為是Caspase-3，在凋亡程序中占據(jù)樞紐地位［10］。缺血性腦卒中所致缺氧和缺糖細胞環(huán)境可上調(diào)Caspase-3前體的表達，引發(fā)Caspase-3前體去磷酸化，使 Caspase-3活化，加速細胞凋亡進程［11］。韓若東等［12］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血造模完成后，經(jīng)染色后發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞Caspase-3陽性表達率升高，細胞凋亡數(shù)目增加，腦部梗死體積較急性發(fā)作期進一步擴大。給予丹參酮ⅡA后，Caspase-3陽性表達率降低，細胞凋亡數(shù)目減少。多項證據(jù)均支持丹參酮ⅡA通過抑制Caspase-3陽性表達而保護腦缺血后的受損神經(jīng)元。

抑制Bax表達：Bcl-2和Bax蛋白是一對重要的內(nèi)源性蛋白質(zhì)，具有細胞凋亡的調(diào)控作用。Bax同時也是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與誘導細胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄過程，而Bcl-2 具有抑制 Bax的作用［13］。Bcl-2 和 Bax蛋白的表達決定細胞的生存情況，當Bax蛋白處于優(yōu)勢地位時細胞死亡速度加快，而當Bcl-2蛋白處于優(yōu)勢地位時細胞死亡速度減慢。在大鼠局灶性腦缺血模型中，Bax蛋白由胞漿快速轉(zhuǎn)移至線粒體，并與Bcl-2結(jié)合，引起線粒體膜通透轉(zhuǎn)運孔的開放，釋放凋亡誘導因子及細胞色素 C，推動細胞凋亡過程［13］。支文煜［14］研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能改善缺血-再灌注引起的Bax表達增高和Bcl-2表達降低，通過抑制線粒體內(nèi)促凋亡蛋白的釋放發(fā)揮抗凋亡作用。

1.3 調(diào)節(jié)凋亡信號通路

神經(jīng)元凋亡是由于細胞內(nèi)死亡程序的啟動致使細胞“自殺”的過程，呈現(xiàn)能量依賴性。神經(jīng)元死亡程序啟動后，神經(jīng)元細胞體積變小，細胞通透性改變，胞質(zhì)減少，細胞核固縮于邊緣，DNA降解，最終形成多個凋亡小體被吞噬細胞吞噬。神經(jīng)元細胞的信號傳導機制十分復雜，目前認為主要信號通路分為外途徑（死亡受體途徑）和內(nèi)途徑（包括線粒體途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑）。

線粒體通路：線粒體通路介導的神經(jīng)元凋亡與缺血性腦損傷嚴重程度有關。嚴重缺血性腦損傷可造成線粒體三磷酸腺苷（ATP）合成不足，細胞能量供應不足，最終因能量枯竭導致神經(jīng)元壞死。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）處于線粒體內(nèi)外膜之間，當細胞遭受到各種外源性刺激時，引起MPTP開放，線粒體通透性增加，線粒體中的細胞色素C被釋放進入胞漿，特異性結(jié)合凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）形成一種多聚復合物，激活 Caspase-3［15］，被激活的 Caspase-3 通過剪切靶細胞DNA依賴性蛋白激酶等，不可逆地改變其結(jié)構(gòu)，促使細胞凋亡。Bcl-2基因是一種癌基因，與其相關的膜蛋白是一種強有力的細胞凋亡抑制因子，其在調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮著關鍵作用。李浩等［16］采用線栓法建立局灶性腦缺血-再灌注模型，發(fā)現(xiàn)造模24 h后，模型組相對假手術組Bcl-2和Caspase-3表達增加。丹參酮ⅡA高、低劑量組較模型組腦組織缺血面積縮小，Bcl-2表達升高，且Caspase-3表達降低。

死亡受體通路：包括死亡因子受體（Fas）／死亡因子Fas配體（FasL）死亡通路及腫瘤壞死因子受體相關蛋白（TNFR）死亡通路。Fas是一種Ⅰ型膜蛋白，相對分子質(zhì)量為45×103；而FasL是一種Ⅱ型膜蛋白，相對分子質(zhì)量為37×103。Fas能與FasL特異性結(jié)合，從而迅速激活caspase-8，引發(fā)一系列級聯(lián)反應，裂解DNA，致使細胞凋亡［17］。韓峰等［18］證明，丹參酮ⅡA能調(diào)控 Fas／FasL死亡通路，抑制Caspase-8的表達，減少肺腫瘤細胞A549細胞凋亡。TNFR死亡通路是通過TNF和TNFR-1的特異性結(jié)合，從而聚集受體死亡結(jié)構(gòu)域。對細胞凋亡有直接和間接2種影響，一是TNFR銜接蛋白（TRADD）可誘導死亡結(jié)構(gòu)域蛋白FADD的聚集，直接導致細胞凋亡；二是TNF和TNFR-1結(jié)合后，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和Apaf-1，相關凋亡因子被釋放，間接導致細胞凋亡進程加快。ZHU等［19］發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可抑制大鼠缺血再灌注后核因子κB亞基p65親和肽（NF-κBp65）的表達，從而降低Apaf-1水平，抑制細胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)廣泛存在于真核細胞中，是細胞內(nèi)重要的細胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為信號傳導的樞紐平臺，參與蛋白質(zhì)合成、折疊和寡聚化，鈣離子的儲存，脂類及類固醇等物質(zhì)的代謝、合成等過程。當細胞受到多種病理生理刺激，如氧化應激反應、缺血缺氧環(huán)境、鈣離子水平失衡及病毒感染等時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應激反應，此過程既能修復早期或損傷較輕的細胞，又能清除過度損傷的細胞，是重要的維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的過程［20］。Parecoxib作為一種新型環(huán)氧合酶-2（COX-2）抑制劑，可抑制腦缺血再灌注損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的神經(jīng)元凋亡，控制腦缺血后缺血半暗帶面積進一步擴大。DONG等［21］發(fā)現(xiàn)，Parecoxib可顯著抑制缺血半暗帶Chop表達及Caspase-12活性，進而減輕神經(jīng)元凋亡，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和信號傳導途徑或可成為缺血性腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療新靶點。

2 抑制炎性反應

2.1 概述

腦缺血-再灌注后，氧自由基及其他信使可活化炎性細胞，釋放趨化因子，上調(diào)黏附分子，白細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞，血流受阻形成“無復流現(xiàn)象”，微血管閉塞，同時聚集的白細胞可釋放氧自由基、蛋白水解酶等作用于內(nèi)皮細胞，破壞血-腦屏障，形成腦水腫，激活的白細胞在微血管內(nèi)聚集，又可釋放大量的炎性介質(zhì)和細胞因子，使更多的中性粒細胞聚集到炎性反應部位，從而加重炎性反應，造成惡性循環(huán)［22］。丹參酮ⅡA通過抑制炎性細胞的活化及趨化因子、炎性細胞因子表達，抑制細胞及體液免疫答應，從而降低炎性反應。

2.2 抑制參與炎性反應的細胞活性

小膠質(zhì)細胞：是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種免疫細胞，可實時反映大腦微環(huán)境情況，并對細胞外信號刺激有一定反應；同時，還具有吞噬表達異常細胞、細胞碎片的能力，在維持正常細胞的平衡中發(fā)揮重要作用。缺血性腦卒中造成的缺血缺氧環(huán)境可引發(fā)神經(jīng)元細胞的異常表達及形態(tài)學的改變，從而激活小膠質(zhì)細胞釋放出多種炎性介質(zhì)和細胞毒性介質(zhì)，誘導細胞損傷及凋亡，最終加重腦損傷。蔡琳等［23］研究證實，丹參酮ⅡA可通過對NLRP 3炎癥體信號通路中的白細胞介素1β（IL-1β）、凋亡蛋白Caspase-1及IL-18的表達產(chǎn)生抑制，進而發(fā)揮OGD／R的BV2小膠質(zhì)細胞損傷的保護作用。

星形膠質(zhì)細胞：可分泌多種炎性介質(zhì)。缺血性腦卒中造成的缺血缺氧環(huán)境可導致機體啟動免疫應激，活化星形膠質(zhì)細胞，分泌與組織相容性較好的復合物和刺激因子，活化T輔助淋巴細胞，抑制IL-12的表達，發(fā)生免疫答應，引起炎性反應。同時，星形膠質(zhì)細胞與小膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應中具有協(xié)同作用。小膠質(zhì)細胞可以分泌細胞因子和氧自由基而影響星形膠質(zhì)細胞活性，而星形膠質(zhì)細胞經(jīng)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子的活化，可以產(chǎn)生炎性細胞因子，兩者相互作用加重缺血-再灌注后神經(jīng)元炎性反應［24］。利用Zea Longa線栓法可以制造大鼠腦缺血性動脈梗死模型，神經(jīng)細胞纖維化，膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）分泌增多，而丹參酮ⅡA可降低GFAP水平，使受影響區(qū)域的細胞炎癥及死亡進程減慢，最終發(fā)揮腦保護作用［25］。

2.3 抑制細胞因子表達

IL：IL-1有2種不同的異形體，即IL-1α和IL-1β，可結(jié)合不同的受體而發(fā)揮作用。丹參酮ⅡA可下調(diào)IL-1β表達，抑制中性粒細胞聚集、浸潤腦部，降低炎性反應［26］，即給予 IL-1β 抗體，預先阻斷 IL-1β 的表達，IL-6是腦炎性損傷的重要因子，腦缺血急性期時機體處于應激狀態(tài)，神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫等系統(tǒng)均處于一種激活的狀態(tài)，IL-6分泌增多，以增加機體抗損傷的修復能力，可減小大鼠腦缺血-再灌注后壞死面積，降低神經(jīng)功能缺失評分，改善神經(jīng)功能。孫有利等［27］的研究發(fā)現(xiàn)，用丹參酮ⅡA預處理后的缺血性腦卒中大鼠，IL-1β及IL-6水平均明顯降低，丹參酮ⅡA發(fā)揮抗炎活性，保護神經(jīng)元。

TNF-α：TNF-α通過多種途徑參與腦損傷，可激活內(nèi)皮細胞，促進血管收縮并維持凝血狀態(tài)，進一步減小腦部血流，加重缺血性腦損傷，并提高腦卒中二次復發(fā)率；刺激急性期反應蛋白合成增加，誘發(fā)炎性反應；促進興奮性氨基酸及一氧化氮（NO）釋放，加重神經(jīng)毒性。丹參酮ⅡA能下調(diào)TNF-α在體內(nèi)的表達，抑制炎性反應［28］。

2.4 抑制趨化因子表達

趨化因子是一類細胞因子，相對分子質(zhì)量較小。此類細胞因子在細胞間信號傳導及炎性細胞招募過程中起到重要作用，分為C-X-C趨化因子和C-C趨化因子。IL-1和TNF-α均可促進趨化因子的產(chǎn)生、并增強其活性。單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）是一種趨化蛋白，在炎性反應中高表達。急性缺血性腦卒中患者腦脊液中的MCP-1表達水平明顯高于健康者。給予丹參酮ⅡA治療后，MCP-1及TNF-α明顯降低，同時可改善腦缺血半暗帶區(qū)白細胞浸潤情況［29］。

2.5 抑制黏附因子表達

細胞間黏附分子（ICAM-1）是一種分布于全身的重要炎性因子，多存在于炎癥部位的細胞表面，在白細胞的遷移和浸潤過程中發(fā)揮重要作用。通常情況下，ICAM-1水平較低，而當受到如 TNF-α，IL-1β，NF-κB等炎性細胞因子刺激后，ICAM-1表達急劇升高。腦缺血后，細胞黏附因子表達升高，從而加強白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附，最終促使白細胞穿越內(nèi)皮細胞到達腦實質(zhì)，因此黏附過程在白細胞跨內(nèi)皮遷移過程中至關重要。KAMIMURA等［30］的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可抑制ICAM-1的表達，抑制白細胞浸潤神經(jīng)細胞，從而緩解局部炎性反應，達到治療缺血性腦卒中的目的。

3 抑制氧化應激過程

氧化應激的基本機制是體內(nèi)氧化-抗氧化動態(tài)平衡被打破，細胞還原電位下降導致氧自由基大量產(chǎn)生，誘發(fā)氧化應激［31］。缺血性腦卒中患者產(chǎn)生氧自由基的過程分為三部分。首先，隨著線粒體去極化水平的降低，產(chǎn)生大量氧自由基；其次，伴隨鎂離子水平升高，ATP代謝產(chǎn)物使黃嘌呤氧化酶被激活，產(chǎn)生氧自由基；最后隨著鈣離子水平的升高，還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化鎂產(chǎn)生氧自由基。

提高超氧化物歧化酶活性：氧自由基是人體在利用氧時產(chǎn)生的損害細胞膜、蛋白質(zhì)和DNA的一種分子，其不能在體內(nèi)穩(wěn)定存在，還會影響到體內(nèi)其他分子的穩(wěn)定性，造成細胞和組織的廣泛性損傷，且與衰老密切相關。氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫的過程需要超氧化物歧化酶（SOD）的催化，過氧化氫繼續(xù)經(jīng)氧化氫酶或谷胱甘肽過氧化物酶分解成為水，清除自由基的過程也是保護機體免受氧化應激傷害的過程。SOD活性間接反映了機體對抗氧化應激、清除自由基的能力。馮晶晶等［32］的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可顯著降低缺血腦組織中脂質(zhì)過氧化物（MDA）的含量，增強SOD活性，并提高ATP水平，降低氧化應激程度，減少體內(nèi)自由基的形成，增加機體清除自由基的能力，并改善能量代謝障礙，這可能與丹參酮ⅡA降低缺血性腦卒中神經(jīng)細胞中鈣離子水平有關。

提高谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）活性：機體內(nèi)廣泛存在的清除氧自由基的催化酶，可清除由氫氧負離子、活性氧誘導形成的MDA，保護細胞膜結(jié)構(gòu)的完整和細胞器功能的健全。LIN等［33］的研究顯示，大鼠經(jīng)腦缺血-再灌注造模后，GSH-Px活性較正常大鼠增強，推測與大鼠缺血后的代償性反應存在一定聯(lián)系，當給予丹參酮ⅡA干預后，GSH-Px活性進一步增強。表明丹參酮ⅡA可以通過提高GSH-Px水平而增強抗氧自由基效用。

4 結(jié)語

丹參可通過以下3個方面保護腦缺血組織：一是抑制炎性細胞的活化過程，減少炎性因子及黏附分子的表達與分泌，減少缺血腦組織中中性粒細胞及白細胞的浸潤、聚集，減輕組織因過度的炎性反應所致?lián)p傷；二是通過抑制細胞相關凋亡誘導因子的表達，調(diào)節(jié)細胞凋亡信號通路，最終抑制受損神經(jīng)細胞的凋亡，縮小腦梗死體積；三是通過提高抗過氧化物酶活性，抑制氧化應激過程，保護腦缺血細胞。以上多數(shù)理論依據(jù)建立在試驗動物模型上，缺少臨床證據(jù)，故應開展大樣本、多中心的隨機臨床試驗研究，以實踐其基礎研究的準確性。