李婷，陳莉智，黃文華，2

1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)國家重點學(xué)科，廣東廣州510515；2.廣東省醫(yī)學(xué)3D打印應(yīng)用轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510515

前言

干細(xì)胞是一類具有極強(qiáng)自我更新復(fù)制和高度增殖分化功能的原始細(xì)胞群體，已成為20世紀(jì)90年代以來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最受關(guān)注的研究熱點。隨著細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，干細(xì)胞已作為“種子細(xì)胞”在體外誘導(dǎo)分化成不同類型的組織和器官。其強(qiáng)大的自我更新和多向分化功能讓它在一定條件下，可以分化為成體干細(xì)胞，并成為各類疾病細(xì)胞療法和基因療法的首選靶細(xì)胞［1］。由于干細(xì)胞具有多系譜分化的可塑性，它能夠在特定的環(huán)境中分化增殖并形成多種組織器官，因此在再生醫(yī)學(xué)中也具有廣闊的發(fā)展前景［2-3］。另外，當(dāng)前在干細(xì)胞的培養(yǎng)方法方面大多數(shù)以2D培養(yǎng)為主，但由于干細(xì)胞生長對培養(yǎng)基結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)物質(zhì)釋放等需求的增加，干細(xì)胞3D支架培養(yǎng)技術(shù)也不斷受到關(guān)注，并成為組織工程的研究熱點［4］。本文針對干細(xì)胞在基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域的研究以及其在臨床治療中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，并就干細(xì)胞在3D打印支架技術(shù)的發(fā)展領(lǐng)域提出展望。

1 干細(xì)胞的生物學(xué)特性

干細(xì)胞是一類同時具有自我復(fù)制與多向分化潛能的細(xì)胞，也是人體造血組織與其他組織中最為原始的細(xì)胞，在醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域被稱為“萬用細(xì)胞”［5］。干細(xì)胞因其來源豐富、易于獲取，目前已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點。它具有多種生物特性，其中最主要的是其自我更新能力、多向分化潛能和高度增殖能力［6］。這些生物特性為干細(xì)胞研究提供有效的研究途徑和支撐，幫助干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域中不斷深入發(fā)展。

1.1 干細(xì)胞強(qiáng)大的自我更新、自我穩(wěn)定能力

干細(xì)胞的生長主要是通過對稱分裂和非對稱分裂兩種方式進(jìn)行。干細(xì)胞不僅可以發(fā)生對稱分裂，形成與自身表型、基因型一致的子代細(xì)胞，也可以通過非對稱分裂形成不同類別的子代細(xì)胞［7］。干細(xì)胞產(chǎn)生分裂后，其子細(xì)胞與母細(xì)胞保持一致，但是同時分別保留其自身原有的細(xì)胞生物特性［1］。干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)形成后，始終具有自我更新能力，能夠良好地維持機(jī)體組織器官內(nèi)的穩(wěn)定性，從而使得組織器官保持生長和衰亡的動態(tài)平衡［2］。

1.2 干細(xì)胞具有極強(qiáng)的多向分化能力

干細(xì)胞具有極強(qiáng)的多向分化能力，既可以連續(xù)分裂，也可以在較長的時間內(nèi)保持靜止?fàn)顟B(tài)。它既可以分化成各種不同的胚層組織細(xì)胞，也能夠分化成同一系統(tǒng)各譜系的細(xì)胞［3］。干細(xì)胞能夠分化成多類細(xì)胞類型，然而不同的干細(xì)胞，其分化的潛能也有所不同。例如，胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cells,ESC）的分化具有全能性，能夠分化發(fā)育出形成機(jī)體的任一組織器官［8］；成體干細(xì)胞則發(fā)育到一定的階段甚至是成體，仍有部分細(xì)胞能夠進(jìn)行分化，并且發(fā)揮組織的更新和修復(fù)作用。干細(xì)胞多向分化的潛能，為損傷組織的修復(fù)再造提供巨大動力，因而干細(xì)胞研究在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也受到廣泛關(guān)注。

1.3 干細(xì)胞高度增殖能力

干細(xì)胞本身的數(shù)量不是很多，但由于其具有多能性，可以通過對其體外增殖進(jìn)行數(shù)量的擴(kuò)增，進(jìn)而對其研究［1］。因此，干細(xì)胞的高度增殖能力具有極其重要的意義。高度增殖作為干細(xì)胞的生物特性之一，不僅能夠維持體內(nèi)的正常功能，并且在體外進(jìn)行擴(kuò)增，也給研究和應(yīng)用提供有效途徑。例如，造血干細(xì)胞能夠通過高速擴(kuò)增，補(bǔ)充正常細(xì)胞衰亡所缺失的血細(xì)胞。而經(jīng)過體外增殖培養(yǎng)所獲得的干細(xì)胞，則能夠為后期的研究需要給予提供和支持。

2 干細(xì)胞的分類

目前研究人員發(fā)現(xiàn)，通過對各類組織和器官的分離，能夠獲取干細(xì)胞。例如，在發(fā)育早期的胚泡內(nèi)細(xì)胞群或原始生殖嵴中可以分離出ESC［8-9］；在特定的誘導(dǎo)后，發(fā)育早期的中胚層和外胚層能夠分化出骨髓、軟骨、肌肉、肌腱等組織細(xì)胞，并且可以從中提取成體干細(xì)胞。按照干細(xì)胞的來源、分化潛能以及發(fā)育階段，干細(xì)胞主要包括兩大類：ESC和成體干細(xì)胞。

2.1 ESC

ESC也稱全能干細(xì)胞。它是經(jīng)過對受孕3～5 d、未著床的囊胚期內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離培養(yǎng)所得到的干細(xì)胞，具有無限增殖和三胚層分化的潛能。ESC的形態(tài)和體積較小，細(xì)胞核較大，核內(nèi)可見一個或幾個核仁。ESC在體外抑制分化培養(yǎng)時，呈較為緊密的排列，各細(xì)胞間界限不清楚。在特定的體外環(huán)境下，ESC化成多種細(xì)胞系，這可以為研究各類細(xì)胞發(fā)育生長建立模型［9］。由于ESC的多向分化和增殖能力，科研人員已將它運(yùn)用于發(fā)育學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物生產(chǎn)、克隆動物、藥物開發(fā)和篩選、組織器官修復(fù)和移植治療等多個領(lǐng)域，并取得重大的成果和進(jìn)展。楊國宏等［9］建立500余個與癌癥和心血管疾病等人類疾病相關(guān)的動物模型，并將這些模型用于藥物篩選中，借助ESC模擬體內(nèi)細(xì)胞對于藥物的反應(yīng)，進(jìn)而為藥物篩選提供更好的模型。

2.2 成體干細(xì)胞

成體干細(xì)胞指的是一類始終保留增殖和分化潛能的成年個體組織中的干細(xì)胞，主要包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（NSC）、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞、臍血間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞等［10-11］。與ESC相比，成體干細(xì)胞更易于在組織來源的細(xì)胞方向進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化，因此更易于向機(jī)體所需的組織細(xì)胞分化培養(yǎng)，發(fā)揮組織細(xì)胞損傷的修復(fù)作用［12］。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有強(qiáng)大的增殖分化能力，還有特殊的免疫調(diào)控特性，能夠多方面同時進(jìn)行作用，對某些免疫性疾病如多發(fā)性硬化癥進(jìn)行調(diào)控治療［13］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞家庭中的重要一員，由于其易于提取、來源廣泛且具有干細(xì)胞的生物特性，使其在組織細(xì)胞移植、基因治療領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。

3 干細(xì)胞的應(yīng)用

3.1 干細(xì)胞在椎間盤退行性病變的研究

椎間盤退行性病變往往會引起嚴(yán)重的腰痛，給患者的日常生活產(chǎn)生負(fù)面的影響。它作為一種普遍存在的慢性疾病，盡管通過臥床休息、理療、抗炎藥物治療以及手術(shù)治療等方法能夠短暫或一定程度上減輕椎間盤退行性病變給患者帶來的痛苦，但依然無法從根本上解決問題［14］。近年來，干細(xì)胞移植技術(shù)成為生命科學(xué)的研究熱點，因此干細(xì)胞療法在椎間盤退行性病變的應(yīng)用也受到廣泛關(guān)注。干細(xì)胞移植處理椎間盤退行性病變，其目的是植入生物活性因子或細(xì)胞以達(dá)到移植異常細(xì)胞因子的生成，或刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成，這樣就能更有效地促進(jìn)椎間盤的修復(fù)再生。Yoshikawa等［15］通過注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞至兩名經(jīng)過椎間盤造影術(shù)后病人的椎間盤內(nèi)24個月，其腰痛和功能均有所改善。

目前，間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞等被廣泛應(yīng)用于干細(xì)胞移植椎間盤治療，其中間充質(zhì)干細(xì)胞主要來源于骨髓、軟骨、臍帶血、軟骨組織等［16］。Chun等［17］將脂肪干細(xì)胞移植入兔椎間盤損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞能夠增加細(xì)胞外基質(zhì)的生成。這些研究闡釋了不同的間充質(zhì)干細(xì)胞移植于椎間盤內(nèi)都能有緩解椎間盤退行性病變的作用。

3.2 干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化的研究

由于配子質(zhì)量問題、生殖細(xì)胞早衰或減少等造成人類生殖障礙疾病，人類面臨的生殖問題沒有得到良好的解決。如果能夠在體外通過誘導(dǎo)干細(xì)胞分化生成生殖細(xì)胞，在人類輔助生殖技術(shù)的幫助下，會為生殖系統(tǒng)疾病的患者帶來福音。

干細(xì)胞是一類具有強(qiáng)大的分化能力的特殊細(xì)胞，它能夠在一定的誘導(dǎo)條件下分化出各類不同的細(xì)胞。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞可以在特定的體外誘導(dǎo)環(huán)境中，誘導(dǎo)分化出早期生殖細(xì)胞、卵母細(xì)胞樣細(xì)胞以及精子樣細(xì)胞等細(xì)胞。Saitou團(tuán)隊在2012年通過動物實驗證明，雌性小鼠的ESC在體外誘導(dǎo)分化后所形成的原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞，與雄性纖體細(xì)胞混合形成“卵巢”，一并移植入受體鼠的卵巢囊膜下，能夠獲得功能性的卵母細(xì)胞［17-18］。這為干細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化提供了有力的證明，也為干細(xì)胞在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供有力的支持和依據(jù)。

3.3 干細(xì)胞在肝臟疾病上的治療

干細(xì)胞療法作為一種新的醫(yī)療技術(shù)，在多種肝臟損傷和疾病中發(fā)揮重要作用。有研究指出，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在特定的條件下通過分化生成肝樣細(xì)胞，并參與肝臟疾病中的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和損傷修復(fù)等［19］。2001年Yamada等［20］通過實驗證明擬胚體具有誘導(dǎo)分化為干細(xì)胞的能力，同時驗證ESC可以分化為肝細(xì)胞。吳玉卓等［21］通過將84名肝功能失代償期患者隨機(jī)分為試驗組和對照組進(jìn)行臨床試驗，對于試驗組進(jìn)行常規(guī)治療加肝左右動脈骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療，隨訪兩年后發(fā)現(xiàn)，實驗組在各方面功能恢復(fù)都優(yōu)于對照組，證明自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療能夠改善肝衰竭患者肝纖維化。

3.4 干細(xì)胞在眼科疾病的研究

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)可以利用誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的方式，生成視神經(jīng)祖細(xì)胞，達(dá)到改善和治療眼科疾病的目的。ESC具有巨大的自我更新和定向分化的潛力，使得其成為眼科疾病中移植療法的理想供體細(xì)胞。Steven等［22］在2014年針對9例Stargardt的黃斑營養(yǎng)不良性患者以及9例年齡相關(guān)性黃斑變性患者進(jìn)行視網(wǎng)膜下移植ESC，移植后并沒有出現(xiàn)不良的排斥反應(yīng)或安全性問題，表明ESC可以應(yīng)用于眼部的移植且安全性良好。同時，也可以通過定向分化，讓干細(xì)胞分泌出能夠抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞衰亡的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，并且利用這些營養(yǎng)因子進(jìn)行替代視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞治療，幫助眼部疾病患者改善和恢復(fù)健康［23］。黃曉峰等［24］指出，干細(xì)胞不僅有定向分化和增殖的能力，還具有良好的移行潛能，可以通過營造促內(nèi)源細(xì)胞恢復(fù)環(huán)境或者誘導(dǎo)分化特定的組織細(xì)胞，形成組織修復(fù)。除此之外，也有研究顯示，對萎縮性視網(wǎng)膜的血管中進(jìn)行整合陰性骨髓源系造血干細(xì)胞是能夠?qū)崿F(xiàn)的，人類自體骨髓細(xì)胞也對視錐細(xì)胞有一定的保護(hù)作用［25］。利用干細(xì)胞技術(shù)對眼科疾病進(jìn)行治療，為眼科疾病患者提供治療的希望和條件。

3.5 干細(xì)胞在口腔醫(yī)學(xué)的應(yīng)用

目前，應(yīng)用于口腔移植的干細(xì)胞種類包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙囊干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞等。乳牙牙髓干細(xì)胞作為牙源性干細(xì)胞的一種，具有多向分化的能力，能夠在特定的條件下分化生成適合的組織細(xì)胞，具有良好的優(yōu)勢。它作為理想的干細(xì)胞來源，在口腔干細(xì)胞移植治療中有良好的應(yīng)用前景。Batoulis等［26］通過動物實驗證明人根乳頭干細(xì)胞和牙周韌帶干細(xì)胞在移植入豬牙損傷模型內(nèi)之后，能成功生成牙根，幫助牙齒恢復(fù)。干細(xì)胞在口腔醫(yī)學(xué)的動物實驗研究中逐漸成熟，研究者也開始探索干細(xì)胞在口腔醫(yī)學(xué)中的聯(lián)合新療法。Iohara等［27］通過將單純牙髓干細(xì)胞移植治療和牙髓干細(xì)胞聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子移植治療進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合療法更能夠促進(jìn)牙本質(zhì)和牙髓再生。目前，生命科學(xué)技術(shù)和口腔醫(yī)學(xué)結(jié)合日益緊密，干細(xì)胞和口腔治療將會成為未來生命科學(xué)的研究熱點。

3.6 干細(xì)胞在糖尿病的治療

糖尿病患者在傳統(tǒng)治療方法上通常沒有根治性的作用，I型糖尿病患者由于自身免疫系統(tǒng)出錯，體內(nèi)幾乎沒有胰島素支撐，只能通過注射胰島素才能在一定程度上控制病情；II型糖尿病患者也由于免疫細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致胰島素缺乏。因此，研究者試圖通過干細(xì)胞療法尋找出新的治療糖尿病的方法。目前，運(yùn)用干細(xì)胞進(jìn)行糖尿病治療的原理主要有4種［28-29］：（1）直接或間接移植一種或幾種干細(xì)胞，利用分化潛能對其進(jìn)行誘導(dǎo)分化；（2）化學(xué)培養(yǎng)誘導(dǎo)體系，在體外分階段進(jìn)行干細(xì)胞誘導(dǎo)，擇其一階段分化所得干細(xì)胞移植入體內(nèi)，進(jìn)一步誘導(dǎo)分化生成組織細(xì)胞，從而逆轉(zhuǎn)高血糖；（3）利用腺病毒或慢病毒進(jìn)行電轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生和胰腺相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而誘導(dǎo)其分化成組織細(xì)胞，發(fā)揮治療作用；（4）將化學(xué)培養(yǎng)誘導(dǎo)體系和基因轉(zhuǎn)染相結(jié)合，促進(jìn)疾病治療。干細(xì)胞治療糖尿病尚處于動物實驗研究階段，但是已經(jīng)驗證成體干細(xì)胞能夠用于糖尿病治療，這種療法將會成為研究熱點。

3.7 干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

帕金森病、老年性癡呆是老年人神經(jīng)系統(tǒng)的常見退行性疾病，近年來干細(xì)胞在這些神經(jīng)性疾病中也開始應(yīng)用。NSC具有分化能力，能夠分化神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等，同時能進(jìn)行自我更新，以供大量腦組織細(xì)胞。Reynolds等［30］用神經(jīng)細(xì)胞球形成法，在表皮生長因子生長條件中，持續(xù)培養(yǎng)懸浮的NSC，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不斷增殖并且形成了由同一來源的NSC細(xì)胞球。Inoue［31］通過誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)將肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）患者的體細(xì)胞誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)成為多能干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)并建立特異性誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系，制備用于ALS的實驗研究的動物模型。Oshimura等［32］采用同樣技術(shù)建立出Duchenne型肌營養(yǎng)不良（DMD）的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系，并制備相應(yīng)的動物模型。對NSC的研究過程中，將會不斷涌現(xiàn)出新的技術(shù)，并為多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的治療帶來希望［33］。

3.8 干細(xì)胞在藥物篩選中的運(yùn)用

干細(xì)胞的應(yīng)用不僅存在于臨床治療當(dāng)中，在藥物研發(fā)方面也發(fā)揮著重要作用。以干細(xì)胞作為藥物篩選的模型，能夠充分利用干細(xì)胞多向分化、自我更新和高度增殖的生物特性，通過高效的篩選模型能夠縮短藥物研發(fā)的周期以及成本［34］。Ying等［35］通過采用MTT法測定化合物對NSC毒性，篩選出80種藥物和殺蟲劑。Tetsuro等［36］使用間充質(zhì)干細(xì)胞篩選768個藥理活性化合物，結(jié)果顯示山奈酚可以誘導(dǎo)堿性磷酸酶表達(dá)并沒有細(xì)胞毒性。通過干細(xì)胞建立藥物篩選模型，能夠為高通量藥物篩選提供更好的支持。

3.9 干細(xì)胞在3D支架上的體外培養(yǎng)

干細(xì)胞能夠在生物體內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增、發(fā)育以及功能復(fù)制等，但由于體外環(huán)境的培養(yǎng)會影響這些功能的發(fā)揮，同時生物微環(huán)境中的細(xì)胞、分子等之間相互的作用也會使干細(xì)胞展現(xiàn)不同的生物活動［4］。3D打印支架可以模擬體內(nèi)細(xì)胞機(jī)制的結(jié)構(gòu)和環(huán)境，幫助干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化、增殖生長盡可能接近體內(nèi)的狀態(tài)。目前，3D殼聚糖支架廣泛運(yùn)用于干細(xì)胞的培養(yǎng)，并有良好的生物活性，Malafaya等［29］構(gòu)建以殼聚糖為材料的3D支架，并將其導(dǎo)入生物體內(nèi)，表現(xiàn)出良好的性能。除此之外，3D支架在造血干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用不斷得到發(fā)展。早期有實驗研究發(fā)現(xiàn)，3D鉭多孔支架材料培養(yǎng)造血干細(xì)胞，能夠使得細(xì)胞數(shù)量比2D培養(yǎng)獲取得更多［37］。干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域的發(fā)展在不斷深入，3D技術(shù)與干細(xì)胞的結(jié)合也將在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中擁有廣闊的研究前景。

4 展望

干細(xì)胞技術(shù)從20世紀(jì)開始不斷走上生命科學(xué)研究的大舞臺，并且在基礎(chǔ)科研和臨床醫(yī)療等各個領(lǐng)域內(nèi)綻放奇光異彩。至今，國內(nèi)外關(guān)于干細(xì)胞的生物特性及其相關(guān)類細(xì)胞等方面已經(jīng)進(jìn)行大量的實驗研究，干細(xì)胞技術(shù)的研究已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止是對其本身進(jìn)行探索，而應(yīng)將其與臨床疾病治療、組織工程以及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)相結(jié)合。在臨床治療方面，可以將干細(xì)胞移植導(dǎo)入體內(nèi)，進(jìn)行誘導(dǎo)分化幫助組織細(xì)胞的損傷修復(fù)或者分泌保護(hù)因子促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)；在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，干細(xì)胞技術(shù)可以與基因重組等方法結(jié)合，干細(xì)胞更有效、安全地轉(zhuǎn)化為另一種干細(xì)胞或成體細(xì)胞，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化率的高效提升；在組織工程方面，干細(xì)胞技術(shù)可以與3D打印支架相結(jié)合，研制出干細(xì)胞最理想的3D環(huán)境，有利于其能在最接近體內(nèi)狀態(tài)的體外3D生物微環(huán)境中進(jìn)行增殖分化，促進(jìn)干細(xì)胞的生長。目前對干細(xì)胞及其分化生成的組織細(xì)胞仍然沒有理想的分離純化、鑒定、繁殖的手段和方法，在臨床進(jìn)行應(yīng)用還存在一定的難度。因此，應(yīng)建立一系列科學(xué)、可靠的技術(shù)手法，完善整個干細(xì)胞系，保證干細(xì)胞技術(shù)的研究更為規(guī)范、科學(xué)。