梁鵬晨，李路易，常慶，史俊峰

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，上海200120；2.上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院臨床科研中心，上海201800；3.上海健康醫(yī)學(xué)院分子影像學(xué)重點實驗室，上海200120

前言

醫(yī)用植入體對于臨床骨缺損修復(fù)非常重要。在過去的5年中，對植入體的需求急劇增加，其中，髖關(guān)節(jié)翻修術(shù)的數(shù)量增加了26%，預(yù)計到2030年增長率將達到137%［1］。植入體相關(guān)感染是骨科手術(shù)常見的并發(fā)癥之一，易發(fā)生在開放性傷口、內(nèi)固定或關(guān)節(jié)返修時。植入體相關(guān)感染能否解決，在很大程度上決定著手術(shù)的成敗。因此研發(fā)出具有抗菌性能且生物相容性好的植入體材料顯得尤為重要。鈦及其合金作為一種金屬材料，以其優(yōu)異的力學(xué)性能、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和骨整合潛力而被廣泛應(yīng)用于骨科植入體領(lǐng)域［2］。然而鈦植入體在生理環(huán)境中，其表面容易被腐蝕，導(dǎo)致磨損碎片的增加以及金屬離子的釋放，從而對機體造成一定的損害，這導(dǎo)致鈦植入體的臨床運用的局限性；同時，鈦植入體表面缺乏有效的抗菌能力，使得植入體容易被細菌感染，有可能導(dǎo)致嚴重的術(shù)后感染并發(fā)癥。此外，由于鈦植入體表面的生物相容性不好，降低了植入體的骨傳導(dǎo)性和骨整合性，導(dǎo)致植入體在體內(nèi)固定不良，增大二次手術(shù)的風(fēng)險。為了克服鈦植入體表面缺陷造成的相關(guān)問題，可以對鈦植入體進行各種類型的表面改性（包括化學(xué)、物理和生物技術(shù)），從而提高鈦植入體表面的生物相容性和抗菌性，以促進植入早期的骨愈合，并且減少植入感染的相關(guān)風(fēng)險［3-4］。通常鈦植入體的表面與體內(nèi)生理環(huán)境會相互作用，因此鈦植入物表面特性將會直接影響植入體的生物相容性和抗菌性［5］。微弧氧化（Micro-Arc Oxidation,MAO）是在鈦、鋁、鎂及其合金等閥門金屬表面形成牢固附著的陶瓷涂層的一種經(jīng)濟、高效的表面處理技術(shù)。如圖1所示，通過MAO處理，可以將一些生物活性元素摻入鈦植入體表面，并且使得植入體表面呈納米多孔結(jié)構(gòu)，這些變化將會進一步改善植入體的生物功能特性，使其更好地運用在臨床中。本研究主要介紹MAO生物功能涂層的研究現(xiàn)狀，聚焦于探討鈣、磷、銀、銅、鋅和硅等生物活性元素以及它們在MAO涂層中的重要作用。

圖1 通過MAO技術(shù)在鈦植入體中添加生物功能元素Fig.1 Biological functional elements added in titanium implants by micro-arc oxidation technology

1 MAO生物功能涂層的研究現(xiàn)狀

1.1 鈦植入入體表面改性技術(shù)

鈦合金的表面改性方法主要有機械方法、物理方法和化學(xué)方法［6］。機械方法用于獲得特定的表面形貌并去除表面污染物。物理方法主要基于等離子體的技術(shù)，用于制備各種涂層并在涂層表面摻入生物活性元素?；瘜W(xué)方法相對更加多樣化，利用酸蝕刻去除污染物并產(chǎn)生清潔和均勻的表面；溶膠-凝膠和化學(xué)氣相沉積用于制造各種薄膜，可以將諸如蛋白質(zhì)、肽的生物分子固定在植入體表面上，從而誘導(dǎo)特定的組織反應(yīng)。

在上述表面改性技術(shù)中，電化學(xué)方法提供諸如溫和的加工條件、非視線操作、低成本以及大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點。鈦及其合金的電化學(xué)改性主要有陽極氧化、電沉積和MAO等方法。其中，當(dāng)傳統(tǒng)陽極氧化過程中施加的電壓高于生長氧化層的介質(zhì)擊穿極限時，氣體釋放量增加，火花放電頻率增加，這種類型的陽極氧化通常被稱為MAO、等離子體電解氧化或微等離子體氧化［7］。

MAO處理通常在由常規(guī)電解槽和高壓輸出電源組成的裝置中進行（圖2），該工藝制備的涂層具有較寬的厚度范圍，為輕質(zhì)材料提供了有效的磨損和腐蝕防護。通過對工藝參數(shù)的調(diào)整，可以生產(chǎn)出具有保護性和多功能性的涂層。近10年來，MAO技術(shù)的發(fā)展為陶瓷涂層提供了與基體結(jié)合強度高、表面形貌和化學(xué)成分可控、耐磨耐腐蝕性能優(yōu)良的陶瓷涂層［8］。

對于鈦植入體，MAO處理使其表面具有更好的生物相容性和抗菌性［5］。通過MAO處理可以使得鈦植入體表面形成多孔和納米結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)特性將有助于成骨細胞快速粘附和增殖［9-11］。MAO技術(shù)可以描述為在電解液中的電化學(xué)氧化反應(yīng)，即等離子體化學(xué)反應(yīng)和熱擴散的組合［12］。因此，MAO中的電解液配方對MAO涂層的化學(xué)組成具有很大的影響。鈣、磷、銀、銅、鋅和硅等生物活性元素，可以通過將其適當(dāng)添加在MAO電解液中，從而嵌入生長在涂層氧化物中，允許對鈦植入體涂層組合物和性質(zhì)進行廣泛的生物功能改性。通過把生物活性元素嵌入在MAO涂層中，從而改善鈦植入體表面的生物相容性和抗菌性，現(xiàn)已成為鈦植入體表面改性研究中的熱點領(lǐng)域。

圖2 MAO裝置示意圖Fig.2 Schematic diagram of micro-arc oxidation device

1.2 含生物活性元素的MAO涂層

1.2.1 含鈣磷的MAO涂層羥基磷灰石是一種生物活性物質(zhì)，可以用來改善植入體與骨組織的生物相容性［13］。羥基磷灰石是由磷酸鈣組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)為Ca10(PO4)6(OH)2，是骨組織的主要化學(xué)成分。在過去的10年中，羥基磷灰石涂層由于其骨整合性和生物相容性而廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。通過在鈦植入體表面制備羥基磷灰石涂層，可以在鈦植入體和周圍骨組織之間形成較強的化學(xué)鍵，有助于提高鈦植入體表面的骨整合性［14］。

在含有Ca-P的電解液中，利用MAO技術(shù)，可以在鈦植入體表面形成羥基磷灰石涂層，從而提高植入體的骨整合性［15］。Wang等［16］通過MAO技術(shù)在含有TiO2溶膠和甘油磷酸鈣的有機電解質(zhì)中，在鎳鈦合金上制備含Ca和P的TiO2涂層，涂層表面顯示出多孔且粗糙的結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明由于Ca和P組合物的摻入，MAO涂層的生物活性顯著提高。在含鈣磷的電解液中制備MAO涂層，隨著Ca/P比的增加，涂層表面微孔的尺寸和深度也在增加，有利于人骨髓間充質(zhì)干細胞的擴散和增殖，從而提高植入體表面的生物相容性［17］。Dos Santos等［18］使用MAO技術(shù)和基于鈣磷的電解液在商業(yè)純鈦基板上制備多孔且均勻的羥基磷灰石涂層，并且進行了成骨細胞培養(yǎng)以驗證鈦材料表面的生物相容性，研究結(jié)果顯示該實驗制備的羥基磷灰石涂層具有良好的細胞活性。

在乙酸鈣和甘油磷酸鈣組成的電解液中，利用MAO技術(shù)在鈦植入體表面制備羥基磷灰石涂層，結(jié)果顯示該涂層具有誘導(dǎo)成骨細胞系SAOS-2細胞產(chǎn)生更高的細胞活力和礦化的作用［19］。也有研究表明純鈦表面生成的粗糙多孔羥基磷灰石涂層能顯著促進MC3T3-E1細胞的早期黏附、增殖及成骨活性［20］。Santos-Coquillat等［21］在含鈣和磷的電解質(zhì)中對純鈦植入物進行MAO處理，細胞生物學(xué)實驗結(jié)果顯示小鼠成骨細胞和破骨細胞在MAO涂層表面上具有良好的細胞粘附、擴增和增殖，沒有細胞毒性跡象出現(xiàn)。

1.2.2 含銅的MAO涂層銅離子刺激人臍動脈和靜脈內(nèi)皮細胞的增殖［22］。銅可以降低間充質(zhì)細胞的增殖速率，增加它們分化為成骨譜系的能力［23］。據(jù)報道，銅對多種病原微生物具有抗菌能力［24］，鈦植入體上的銅涂層已被證明可以減少體內(nèi)細菌感染［25］；與抗菌活性更廣為人知的銀不同，銅是體內(nèi)的必需元素，因此可能更適合于體內(nèi)應(yīng)用［26］。將銅摻入生物材料中可以增強成骨和血管生成活性以及抗菌活性，從而減輕植入物相關(guān)感染［27］。

有研究報道，利用MAO技術(shù)在鈦植入體上制備含銅的陶瓷涂層時，銅的摻入不會顯著改變涂層的表面形貌和粗糙度，高濃度的Cu-MAO涂層還顯示出增強巨噬細胞介導(dǎo)的成骨和殺菌能力［28］。Yao等［29］通過MAO技術(shù)將銅納米顆粒（CuNPs）成功摻入涂層中，該涂層表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌活性，研究發(fā)現(xiàn)該涂層的抗菌能力可能是由兩種機制共同作用：涂層表面銅納米顆粒接觸殺滅細菌和涂層中銅離子釋放到溶液中殺滅細菌。Zhu等［30］利用MAO技術(shù)，在一種新型的含銅電解液中制備了多孔和納米結(jié)構(gòu)的銅摻雜TiO2涂層，結(jié)果表明銅元素的加入對TiO2涂層的形貌結(jié)構(gòu)和晶相組成沒有明顯的影響，摻銅的氧化鈦涂層對金黃色葡萄球菌的粘附有較好的抑制作用，并具有良好的促進人骨肉瘤細胞（MG63）粘附、早期增殖和晚期分化的生物學(xué)活性。

上述研究說明含銅的MAO涂層既有抗菌能力也具有一定的促成骨能力，但也有研究表明含銅涂層具有一定的細胞毒性。Zhang等［27］在不同濃度的銅納米粒子的電解液中，用MAO技術(shù)在鈦表面沉積了含有不同量的銅納米粒子的多孔TiO2涂層，研究表明由于釋放殺滅和接觸殺滅的綜合作用，銅納米粒子涂層表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌活性，但是銅納米粒子含量較高時，涂層顯示出明顯的細胞毒性，此外CuNPs涂層可增加與血管生成相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子的表達和一氧化氮（NO）的產(chǎn)生。

1.2.3 含銀的MAO涂層臨床上為了對骨缺損疾病進行修復(fù)，廣泛使用了幾種生物醫(yī)學(xué)材料，例如金屬材料、羥基磷灰石材料、可生物降解的聚合物材料和復(fù)合材料，盡管這些材料都具有較好的生物相容性，但通常不具備抗菌能力［26］。骨科植入手術(shù)后相關(guān)細菌的感染已成為目前臨床中亟需解決的問題，臨床上需要抗菌性較好的植入體。銀以其優(yōu)良的抗菌性被廣泛應(yīng)用于抗菌涂層中。銀是一種廣譜的抗菌劑，以離子和金屬形式發(fā)揮抗菌作用［31］。細菌對Ag納米顆粒（AgNPs）的耐藥性較低［32］。

Song等［33］通過MAO技術(shù)在含低Ag的電解質(zhì)溶液中，成功制備了具有生物相容性和抗菌活性的含Ag磷酸鈣涂層。也有研究在含有銀納米顆粒的Ca/P基電解液中利用MAO技術(shù)，使得鈦植入體表面形成具有生物功能的含銀涂層，體外和離體測定顯示這些含AgNPs的新型植入體具有強抗菌活性，并且沒有任何細胞毒性跡象［34］。Teker Aydogan等［35］在含有Ca(CH3COO)2·H2O和Na2HPO4的基礎(chǔ)電解質(zhì)中，分別添加或不添加醋酸銀（AgC2H3O2），從而對商業(yè)純鈦進行MAO處理，然后將樣品進行抗菌活性和細胞活性檢測，結(jié)果顯示與無Ag的MAO涂層相比，摻入Ag的MAO涂層對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌特性，并且在7 d的孵育時間內(nèi)不抑制肉瘤成骨細胞SAOS-2細胞的活力。利用MAO技術(shù)在鈦植入體上摻入Ag納米顆粒而開發(fā)的新型涂層具有較好的抗菌性能，為解決臨床植入手術(shù)感染具有重要意義。

He等［36］采用磁控濺射和MAO相結(jié)合的復(fù)合處理方法，在鈦基種植體表面成功地制備了鍶和銀負載的多孔TiO2涂層，進行一系列實驗后,發(fā)現(xiàn)最佳銀、鍶含量的Sr/Ag復(fù)合TiO2涂層具有持久的抗菌活性、良好的細胞相容性（促進成骨細胞的鋪展和分化）。Muhaffel等［37］將Ti6Al4V試樣在含有無水醋酸鈣和無水磷酸氫二鈉的基礎(chǔ)電解液中，分別加入或不加硝酸銀（AgNO3）進行MAO制得試驗樣品后進行抗菌檢測，結(jié)果顯示與不含AgNO3的基礎(chǔ)電解液相比，添加AgNO3的基礎(chǔ)電解質(zhì)制備的涂層在模擬體液（SBF）中具有更好的生物活性，并且對大腸桿菌菌株具有更好的抗菌活性，且平板計數(shù)結(jié)果表明含銀涂層的抗菌效果是無銀涂層的4倍以上。鑒于Ag離子的摻入可以有效提升植入體表面抗菌能力，通過MAO技術(shù)將Ag納米離子嵌入鈦及鈦合金表面涂層而獲得更佳的骨修復(fù)材料已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點。

1.2.4 含鋅的MAO涂層鋅是哺乳動物體內(nèi)最重要的微量元素之一，其對成骨細胞的增殖具有激活作用，同時鋅還參與多種細胞分裂相關(guān)激素和酶的合成，促進細胞分化［38］。

MAO摻鋅微孔納米涂層能有效促進成骨細胞MG63的粘附、增殖與分化［39］。氧化鋅（ZnO）化學(xué)修飾的鈦表面也具有顯著的抗菌能力［40］。鋅不僅可以促進骨形成，還可以抑制細菌粘附，因此含鋅涂層的鈦植入體可以較好地解決目前臨床上遇到的問題。

含鋅植入材料在體內(nèi)可產(chǎn)生明顯的抗菌作用,抑制金黃色葡萄球菌或大腸桿菌引起的植入物相關(guān)感染［41］。劉宏銘等［39］發(fā)現(xiàn)MAO摻鋅微孔納米涂層具備良好的抗菌性能,對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都具有明確的抗菌作用。因此含有MAO摻鋅涂層的生物材料有望開發(fā)成新型的抗菌植入體。Zhang等［42］研究表明Zn2+和Ag納米顆粒共摻雜的MAO涂層對金黃色葡萄球菌具有持久的抗菌性能。雖然鋅具有廣泛的抗菌作用，但高濃度的鋅被認為具有細胞毒性［43-44］。據(jù)報道鋅離子的毒性影響哺乳動物細胞共有的基本代謝功能［45］。王丹寧等［46］研究表明低濃度MAO鋅涂層可以促進成骨細胞（MG63）的生長，而高濃度MAO鋅涂層則抑制MG63細胞的生長。Zhao等［47］在鈦植入體上制備了不同鋅含量的MAO涂層，并評價了這些涂層對MG63細胞活性和變形鏈球菌抑菌作用的影響，結(jié)果表明鋅在電解液中0.199%～0.574%的濃度范圍內(nèi)對成骨細胞的細胞活性和對變形鏈球菌的抑菌作用均有促進作用，而較高的鋅含量則可能對骨細胞的活性有不良影響，但鋅含量越高，對成骨細胞的抑制作用越強，對變形鏈球菌的抑菌作用也越強。

因此，謹慎的做法是在植入體表面摻入適量的鋅，以將鋅對組織細胞的毒性降至最低，并且也能達到所需抗菌目的。通過MAO技術(shù)，在鈦植入體表面制備含鋅涂層，有望提高植入體的抗菌能力和細胞相容性。但是，目前對鈦植入體含鋅涂層的毒性研究較為薄弱，這使得其臨床應(yīng)用受到局限。

1.2.5 含硅的MAO涂層硅是健康骨骼和結(jié)締組織所需的必需微量元素［48］。Si-TiO2納米管層可以有效促進成骨細胞MC3T3-E1的粘附及分化［49］。Wang等［50］研究表明Si-TiO2涂層顯著促進了MC3T3-E1細胞的早期增殖、后期分化和骨礦化能力；此外，Si-TiO2涂層可通過上調(diào)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5的表達和下調(diào)Dickkopf-1（Dkk1）的表達來刺激成骨細胞增殖、分化和礦化，這可能使得Si-TiO2涂層具有進一步應(yīng)用的巨大潛力。Hu等［51］采用MAO制備了含有多孔納米結(jié)構(gòu)表面的硅摻雜涂層，結(jié)果表明Si-MAO涂層顯示出比MAO涂層更高的MG63細胞增殖率和活力。楊小明等［52］研究表明鎂合金ZK60的含硅MAO涂層可促進成骨細胞增殖、黏附及分化。因此利用MAO技術(shù)將硅元素摻入鈦植入體表面對改善鈦植入體的骨整合性具有較大意義。

2 結(jié)語

骨缺損是由損傷、病理性疾病或外科手術(shù)干預(yù)引起的。用于治療骨缺損的常規(guī)方法，即自體骨移植、同種異體骨移植和異種骨移植，遇到了諸如體內(nèi)排斥、細菌感染、供體不足和宿主的免疫反應(yīng)的限制。因此，能否通過人工合成植入骨材料規(guī)避自體骨和異體骨移植的缺陷是骨科臨床迫切需要解決的問題。

生物醫(yī)用金屬鈦及其合金因其較好的生物力學(xué)性能及生物相容性，在臨床骨缺損修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。但是鈦植入體的骨整合性弱,植入體內(nèi)后只能與骨以機械鎖合的方式結(jié)合而非骨性結(jié)合，并且鈦本身不具有抗菌能力,容易引起細菌粘附,導(dǎo)致鈦植入體感染和松動等一系列并發(fā)癥。

利用MAO技術(shù)，使得鈦植入體表面獲得納米多孔的形貌結(jié)構(gòu)以及多種生物活性元素的摻入，這對解決鈦植入體的臨床運用局限性具有重要的意義。MAO的納米多孔形貌結(jié)構(gòu)有助于成骨細胞的粘附與增殖，使得鈦植入體的骨整合性提高。目前國內(nèi)外的研究中對植入體進行MAO處理時，傾向于在基礎(chǔ)的鈣磷電解液中添加一種或多種生物活性元素，從而賦予植入體多種生物功能特性。在摻入幾種元素的生物功能涂層中，電解液中元素的配比對于涂層的性質(zhì)具有較大作用，通過研究不同元素配比的電解液制備的MAO涂層的特性，可以為開發(fā)新型多功能的鈦植入體提供幫助，使得植入體兼有良好的生物相容性和抗菌性。但是某些功能元素在較大劑量時往往具有毒性，因此功能元素的添加劑量與植入體生理毒性的研究也應(yīng)該得到重視?？梢酝ㄟ^研究不同劑量的元素摻入量對涂層的細胞學(xué)毒性實驗影響，從而探究安全的電解液元素濃度范圍。

目前在研究MAO涂層的生物功能性時，多進行體外細胞學(xué)實驗，但是細胞學(xué)層面往往不能全面地反映植入體在體內(nèi)的生理作用，因此利用動物骨缺損模型研究植入體的體內(nèi)植入效果具有重要的意義。在以后研究中，可以增加體內(nèi)動物骨缺損模型的實驗，從而對植入體特性進行綜合的評價。

總之，MAO技術(shù)已被證明是用于增強鈦植入體的骨整合性和抗菌性的有效表面處理，并且開發(fā)多種化學(xué)組成的多孔涂層是MAO技術(shù)最具吸引力的特征。鑒于鈦植入體與周圍組織環(huán)境的相互作用主要發(fā)生在植入體的表面，對鈦植入體進行適當(dāng)?shù)腗AO處理，提高其表面的生物活性，進而促進鈦植入體的骨整合和抗菌性，具有重要的臨床研究意義。