文 /李志廣 閉鳳麗 張凌云 劉波 張德明 劉嘉祺 譚美凌

在線固相萃取-三重四級桿液質聯(lián)快速測定水中氯霉素（CAP）的方法開發(fā) // 本方法采用Waters OA在線固相萃取裝置，簡化復雜的離線固相萃取操作，降低人工成本，提高分析效率，該方法靈敏度高，可移植性好，可滿足氯霉素在水體的痕量快速檢測。

抗生素面世以來,人們找到抑制細菌生長的方法，大衛(wèi)教授于1947年發(fā)現(xiàn)可產(chǎn)生氯霉素的鏈霉菌，1949年氯霉素引入臨床使用。近代，氯霉素因價格低廉曾大量應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)及水產(chǎn)業(yè)，氯霉素的不完全代謝會殘留在動物肉制品及水產(chǎn)品中，人類食用含有氯霉素的動物制品時，可能導致造血障礙等毒副作用。

現(xiàn)代人長期暴露在抗生素環(huán)境中，人體在食物中積累抗生素，導致細菌產(chǎn)生耐藥性，同時也有報道指出抗生素會對人體造成毒理損害和三致風險。在國內(nèi)，人們對抗生素的消耗巨大，大部分抗生素不能被人體完全吸收?？股丶捌浯x產(chǎn)物可通過排泄的方式進入到生活污水，在污水處理中抗生素可能會影響到地下水和環(huán)境地表水，對水生生物和土壤有潛在風險。有文獻指出在1992年，氯霉素類和頭孢類內(nèi)酰胺類抗生素年用量為18 t，占總抗生素用用量的52.9%。Sacher等人分析了德國巴登維爾茨堡105個地下水井，抗生素檢出率較高。有人分析了珠江廣州河段中氯霉素的一年中含量在 11-266 ng/L。

目前，抗生素的環(huán)境生態(tài)學研究較少，在土壤的殘留時間與其代謝有關,可能在雨水沖刷土壤的情況下對地下水造成污染。廢水和水環(huán)境中的藥物污染已經(jīng)引起了人們的注意。隨著抗生素廣泛使用，環(huán)境中檢測到的抗生素種類繁多，其環(huán)境殘留濃度也逐年升高。另外，由于抗生素對生態(tài)平衡的影響和人體健康潛在威脅的暴露，抗生素的環(huán)境行為倍受人們關注。人類過量攝取抗生素風險的主要途徑是食物和受抗生素污染的飲用水?？股卦诃h(huán)境水體中的含量極低，需對目標化合物富集才能對其進行定量檢測。

目前，抗生素檢測方法有高效液相色譜法、液相色譜質譜聯(lián)用法、荷移分光光度法等。其中液質聯(lián)用法因其分離效果好，靈敏度高，在實際應用中使用最多。傳統(tǒng)液質連用法前處理使用手工固相萃取進行富集，然后用液質聯(lián)用進行檢測。手工固相萃取富集方法繁瑣，耗費大量時間和人力物力，不適用于大批量做樣品和應急檢測等特點。本文采用的是沃特世公司的全自動在線前處理-超高效液相色譜串聯(lián)質譜聯(lián)用系統(tǒng)，系統(tǒng)使用在線固相微萃取系統(tǒng)，僅需對樣品進行簡單的過0.22μm濾膜處理，利用在線固相萃取技術，可快速對樣品進行富集，節(jié)省分析時間。集成化的在線固相處理系統(tǒng)應對抗生素水體污染突發(fā)事件，具有快速出具數(shù)據(jù)，重復性好，方法可移植性強等特點。

實驗方法

儀器與設備

超高效液相色譜-三重四級桿質譜系統(tǒng)（Waters Quattro Premier XE）美國；

全自動在線固相萃取前處理儀（2777C Sample Manager）美國；

超純水系統(tǒng)（Thermo MicroPure UV）德國；

圖1 全自動在線固相萃取儀的工作原理

在線固相萃取柱（Waters Oasis HLB Direct Connect HP（2.1 x 30 mm，20μm））美國；

濾膜（安譜PTFE針式濾器（水系）0.22μm）中國。

全自動在線固相萃取儀的工作原理見圖1，四元溶劑泵（QSM）和二元溶劑泵（BSM）分別服務于樣品萃取富集系統(tǒng)以及液相檢測系統(tǒng)。分析過程分為樣品萃取富集以及樣品檢測階段。在樣品萃取富集階段，從2777C進樣器進樣5 ml樣品，通過四元溶劑泵（QSM）采用2 ml/min水溶液將樣品加載在萃取柱1上，待目標化合物全部加載在萃取柱1后，使用B溶劑和C溶劑按一定比例作為淋洗液除雜。清洗除雜后，切換萃取柱A到UPLC系統(tǒng)，通過二元溶劑泵（BSM）采用高有機相比例，將萃取柱1上吸附的目標化合物洗脫到UPLC系統(tǒng)中進行樣品檢測。在萃取柱1的洗脫過程中，萃取柱2在四元溶劑泵（QSM）中進行再生，恢復萃取柱初始條件等待下一次分析。

主要試劑

標準品：氯霉素（CAP）、購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH，所有標準品純度≥ 94.0%。

普通試劑：乙腈、甲醇、甲酸、丙酮均為色譜純。

標準溶液的配制與儲存：準確稱取10.0 mg標準品于10 mL容量瓶中，由甲醇溶液稀釋定容為1.00 mg/mL的標準儲備液。標準儲備液于-4 ℃下密封、避光保存，使用時應恢復至室溫，并搖勻。使用時，取適量標準儲備液，用純水稀釋至所需濃度。

在線固相萃取條件

目標分析物的在線萃取條件詳見表1及表2。

UPLC-MS/MS 條件

質譜條件：氯霉素用負離子模式（ESI-）的毛細管電壓3.0 kV；萃取電壓3 V；透鏡電壓0.1 V；離子源溫度120℃；脫溶劑溫度450 ℃；輔助氣流速1000 L/h；錐孔N2流速50 L/h；碰撞氣Ar流速0.15 mL/min。目標分析物的質譜檢測參數(shù)詳見表3。

方法優(yōu)化

1.樣品PH

當樣品的PH=7時,目標化合物的信號較強。氯霉素在水溶液PH=4.5-7較穩(wěn)定，堿性條件下，氯霉素不穩(wěn)定，易發(fā)生水解。在酸性條件下，可發(fā)生酰胺水解，選擇PH=7作為樣品PH。

表1在線固相萃取條件四元泵設置

表2 檢測流動相二元泵設置

表3 目標分析物的質譜檢測參數(shù)

表4 目標分析物的標準曲線及方法檢出限

2.萃取柱

在富集柱選擇上，當使用HLB萃取柱時，氯霉素的響應值明顯高于C18柱。由于兩種目標化合物有羥基，帶有一定極性。C18柱為反向萃取柱，對極性化合物保留較差。HLB柱也為反向萃取柱但因其載體中帶有特殊親水基團對極性化物也有較好的富集效果，吸附效果較傳統(tǒng)硅膠基質SPE（如C18）好，選擇HLB柱作為萃取柱。

3.流動相

當流動相為乙腈-0.1%甲酸水時，氯霉素信號大幅下降。當流動相為乙腈-水時，氯霉素的信號增強。酸性條件下不利于氯霉素負離子電離，氯霉素液相流動相條件選擇乙腈-純水。

4.上樣溶液

本在線固相萃取系統(tǒng)把四元泵中A相溶液作為上樣溶液,通過四元泵把樣品富集到HLB小柱。上樣溶液對富集效果影響較大。當使用0.05%甲酸溶液作為上樣溶液時，目標物響應值下降，選取100%純水作為上樣溶液。

方法驗證

標準曲線繪制

用純水將混合標準溶液稀釋成濃度為 10、20、40、80、160、320 ng/L的系列工作溶液，在最佳試驗條件下進行測定，以各化合物峰面積Y對質量濃度X進行線性回歸，兩種抗生素的回歸方程、相關系數(shù)和方法檢出限見表4。

從表中可以看出，氯霉素10-320 ng/L濃度范圍內(nèi)峰面積與質量濃度呈現(xiàn)良好的線性關系。目標抗生素的方法檢出限為氯霉素：1.63 ng/L，測定下限為氯霉素：6.52 ng/L，可滿足水環(huán)境中抗生素痕量分析的要求。

方法準確度與精密度

取空白水樣（純水），加入一定量的標準溶液，獲得10 ng/L的加標樣品，全過程分析，平行測定11份，做精密度測試，相對標準偏差見表5。

表5 純水加標回收試驗結果（n=11）

表6 實際水樣加標回收試驗結果（n=11）

取實際水樣，加入一定量的標準溶液，獲得100 ng/L的加標樣品，全過程分析，平行測定11份，做加標回收測試，各組分回收率表6。

從表中可以看出，空白水樣平均加標回收率為94.2%-115.9 %，地表水水樣平均加標回收率為88.12%-102.90%，方法的準確度良好。空白加標水樣測試的相對標準偏差為5.74%，地表水加標水樣測試的相對標準偏差為6.34%，方法的精密度良好，滿足水中檢測要求。

結論

相對于傳統(tǒng)固相萃取技術，在線固相微萃取技術前處理簡單，僅需將20 ml水樣過0.22μm濾膜，每個樣品檢測時間為11分鐘，能節(jié)省大量前處理時間和人力成本。傳統(tǒng)固相萃取技術因上樣時間，洗

脫速度等條件不易控制，實驗誤差與人操作關系較大。在線固相微萃取技術能減少人為誤差，提高實驗重復性。本文方法使用MRM模式進行定量，CAP的方法檢出限為1.63 ng/L，線性范圍為10-320 ng/L，相關系數(shù)R=0.9999，實際水樣回收率為80.69%-102.90%，相對標準偏差為6.34%，滿足水中痕量分析的要求。