韓 煦 ，皮佳鑫 ，張 瀛 ，王舒雅 ，張 兵 ，李 雯 ，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術教育部工程中心，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 300193）

隨著新型栓劑的不斷涌現(xiàn)，有關于栓劑溶出度的研究也越來越受到人們的重視，溶出度在一定程度上反映了有效成分從制劑中溶出的程度，栓劑中主藥的粒度、基質(zhì)的比例等均是栓劑溶出速率的重要影響因素，因此栓劑的溶出度對于栓劑的處方設計、質(zhì)量評價等方面均具有重要意義[1]。國內(nèi)對于傳統(tǒng)栓劑的體外溶出度測定研究主要應用《中華人民共和國藥典》收載的溶出度測定法槳法、籃法、小杯法[2]，然而傳統(tǒng)的溶出方法在測定栓劑溶出度方面存在許多問題，例如樣品漂浮問題、無法真實模擬腔道給藥環(huán)境等[3-4]。

流通池法是一種針對傳統(tǒng)溶出度測定方法不足建立起來的新型溶出度測定方法：其克服了傳統(tǒng)溶出度測定法方法因缺乏下沉條件所引起的偏差、在測試過程中可以改變pH條件、能夠通過溶媒的不同流動方式真實模擬體內(nèi)的環(huán)境[5-6]。流通池法具體分為開環(huán)式和閉環(huán)式兩種，開環(huán)式流通池可以保證大量新鮮的溶出介質(zhì)不斷接觸被測樣品，所以非常適用于一些大劑量、難溶性藥物溶出度的測定；閉環(huán)式流通池是將樣品固定在特定的樣品架上，通過恒流泵入小劑量的溶出介質(zhì)，使介質(zhì)與樣品不斷接觸，適用于緩控釋制劑、植入劑、貼劑、栓劑、脂質(zhì)體等的溶出度測定[7-9]。近年來流通池法越來越廣泛成為一些新劑型藥物溶出度的測定方法，國內(nèi)外許多研究相繼報道了流通池法測定溶出度可以更好的獲得體內(nèi)外相關性[10-12]，這對于通過考察藥物體外釋放特征，預測在體內(nèi)的作用特征，從而指導臨床應用具有至關重要的作用。

消糜栓是一種在腔道內(nèi)起局部作用，用于治療女性陰道炎的的藥物，含有苦參、黃柏、紫草、兒茶、人參莖葉總皂苷、枯礬、冰片等主要成分，具有起效快，生物利用度高等特點，臨床上已被應用廣泛[13]，但相關質(zhì)量研究較為匱乏。筆者在前期建立了改良小杯法測定消糜栓的溶出度實驗方法，并測定了苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿5種指標成分。筆者進一步應用流通池法進行中藥栓劑消糜栓5種指標成分的溶出度研究，以考察流通池法對于消糜栓溶出度測定的適應性，評價不同溶出介質(zhì)、不同流速下消糜栓中指標成分的溶出度特性。

1 儀器與材料

LC-20A島津高效液相色譜儀（日本島津公司），Sotex CE7 Offline流通池溶出儀（瑞士Sotex公司）；BPll0S分析天平（德國Sartorius公司）；XP205十萬分之一天平（Mettler Toledo）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore）；SB-3200D數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。消糜栓（通藥制藥集團股份有限公司，批號：171101），苦參堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110805-200508），兒茶素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110877-201203），表兒茶素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110878-200102），鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110713-201212），人參皂苷Re對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110754-201324），其他化學試劑均為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶出介質(zhì)中5種成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0．05%磷酸水（B），梯度洗脫（0-18 min，5%A→16%A；18-20 min，16%A→24%A；20-41 min，24%A；41-43 min，24%A→85%A；43-48 min，85%A；48-50 min，85%A→5%A；50-60 min，5%A）;檢測波長：203 nm 和 265 nm；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿適量，加甲醇適量溶解，配制成每1 mL含苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷 Re、鹽酸小檗堿分別為 0．3、4．82、3．53、1．31、0．07 mg/mL 的對照品儲備液，備用。

2.1.3 線性關系考察 取“2．1．2”配制的對照品儲備液，用甲醇稀釋成系列濃度，按“2．1．1”色譜條件測定色譜峰面積，以標準品濃度（μg/mL）為橫坐標（X），色譜峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿的線性方程分別為Y=20 653X-6 041．3（r=0．999 8），Y=3 762．5X+24 090（r=0．999 6），Y=3 735．8X+18 582（r=0．999 5），Y=2 140．7X+4 162．2（r=0．999 7），Y=45 027X-5 587．9（r=0．999 8），線性范圍分別為 1．02～30．02 μg/mL、15．06～481．96 μg/mL、11．05～353．44 μg/mL、4．10～131．11 μg/mL、0．26～7．2 μg/mL。

2.1.4 精密度實驗 取“2．1．2”配制的對照品儲備液，用甲醇稀釋成一定濃度，在“2．1．1”色譜條件下，連續(xù)進樣6次，每次10 μL，測定色譜峰面積，得苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿的 RSD%（n=6）分別為 1．21%，1．44%，1．37%，1．14%，1．79%。

2.1.5 穩(wěn)定性實驗 取消糜栓1粒（3 g），制備溶出液，取 30 min 的溶出液 10 μL，于 0、2、4、8、12、24 h在“2．1．1”色譜條件下測定色譜峰面積，得苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿的RSD%（n=6） 分別為 1．90%、0．31%、0．40%、2．89%、2．85%。

2.1.6 回收率實驗 稱取3 g消糜栓空白基質(zhì)，置于溶出杯中，加入200 mL超聲脫氣的蒸餾水，37℃水浴下加熱，攪拌1 h，作為空白基質(zhì)溶液。取“2．1．2”配制的對照品儲備液，以空白基質(zhì)溶液稀釋，制成低、中、高3種不同濃度的混合供試品溶液（n=3）；同時用甲醇溶液稀釋，配制相同濃度的混合對照品溶液（n=3）。按照“2．1．1”的色譜條件測定峰面積，計算低、中、高3個濃度的平均回收率（n=3），結(jié)果見表1。

2.2 溶出度檢查法 采用流通池閉合系統(tǒng)裝置，每次實驗取消糜栓樣品3粒，置于錐形部裝滿1 mm玻璃珠的流通池內(nèi)，分別以水（超聲脫氣）和醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4．5）200 mL作為溶出介質(zhì)，在流通池內(nèi)以層流方式流動，溫度設定為37℃。分別設定流速為 4、8 和 16 mL/min，于 15、30、45、60、75、90、105、120、150、180 和 240 min 取樣 2 mL，濾過，按照“2．1．1”的色譜條件測定峰面積，應用外標一點法，在203 nm計算苦參堿、人參皂苷Re的溶出量（mg），在206 nm計算兒茶素、表兒茶素、鹽酸小檗堿的溶出量（mg）。

在8 mL/min流速下，考察兩種不同溶出介質(zhì)水、醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）對消糜栓中苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿的溶出度測定的影響，選取3個時間點：30、120、240 min的溶出量，利用SPSS 17統(tǒng)計軟件進行兩獨立樣本t檢驗比較分析。在兩種介質(zhì)中消糜栓的平均溶出量（mg）及t檢驗分析的顯著性結(jié)果見表2所示。

表2 兩種溶出介質(zhì)中消糜栓5種成分溶出量及t檢驗顯著性分析（±s）

表2 兩種溶出介質(zhì)中消糜栓5種成分溶出量及t檢驗顯著性分析（±s）

成分 水中溶出量（mg）苦參堿 1.15±0.10 1.29±0.19 0.330 1.98±0.03 2.48±0.15 0.005 2.24±0.05 2.59±0.11 0.006兒茶素 49.19±2.56 48.03±3.35 0.658 79.19±2.01 83.42±4.13 0.185 88.84±1.18 86.50±2.12 0.171表兒茶素 7.85±0.51 7.63±0.67 0.675 13.07±0.37 13.78±0.63 0.167 13.59±1.09 13.83±0.76 0.774人參皂苷 Re 3.49±0.69 3.01±0.38 0.348 7.53±1.47 6.42±1.24 0.375 8.98±0.35 6.61±0.94 0.015鹽酸小檗堿 0.46±0.06 0.43±0.07 0.594 1.03±0.07 0.82±0.07 0.016 1.05±0.06 0.88±0.06 0.006 n 3 3 3 3 3時間（min）30 120 240 30 120 240 30 120 240 30 120 240 30 120 240酸性介質(zhì)中溶出量（mg） P

結(jié)果顯示，兩種溶出介質(zhì)對于3個時間點下消糜栓中兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re的溶出無顯著影響（P＞0.05），對于苦參堿、鹽酸小檗堿在30 min無顯著影響（P＞0.05），在 120 min、240 min 具有顯著影響（P＜0.01）。

以水為介質(zhì)時，在3種不同流速下，根據(jù)消糜栓樣品中主要成分的溶出量（mg）繪制溶出曲線，結(jié)果如圖1-5所示。

由圖1-5的溶出曲線可知，消糜栓5種指標成分在流速為4、8和16 mL/min時溶出行為不同，在4、8 mL/min流速下溶出速率較慢；當流速為16 mL/min各成分的溶出速率最快。實驗結(jié)果表明，流速對于消糜栓中苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿的溶出行為具有明顯的影響，且流速越大，溶出速度越快。

圖1 水為介質(zhì)時不同流速下苦參堿的溶出曲線（n=3）

圖2 水為介質(zhì)時不同流速下兒茶素的溶出曲線（n=3）

圖3 水為介質(zhì)時不同流速下表兒茶素的溶出曲線（n=3）

圖4 水為介質(zhì)時不同流速下人參皂苷Re的溶出曲線（n=3）

圖5 水為介質(zhì)時不同流速下鹽酸小檗堿的溶出曲線（n=3）

以水為溶出介質(zhì)時，在不同流速下，選取3個時間點：30、120、240 min各成分的溶出量，利用SPSS 17統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示流速的變化對于這3個時間點下苦參堿、兒茶素、表兒茶素3種成分有極顯著影響（P＜0.01），對于人參皂苷Re和鹽酸小檗堿，在30 min具有顯著影響（P＜0.05），在 120 min及240 min無顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

流通池法測定消糜栓溶出度條件的改變主要有改變流速、改變?nèi)苊搅鲃臃绞剑淖內(nèi)艹鼋橘|(zhì)以及改變?nèi)艹鼋橘|(zhì)體積等方面[14]。根據(jù)前期對于消糜栓傳統(tǒng)溶出度測定方法的研究結(jié)果表明，槳法、籃法測定消糜栓溶出度時，人參皂苷Re、鹽酸小檗堿在溶劑中的濃度較低，不利于測定，采用溶出介質(zhì)體積較小的小杯法更能反映消糜栓各指標成分的溶出特性，且滿足漏槽條件，在本實驗中流通池法的溶出介質(zhì)體積選用小杯法所用體積200 mL。

流通池法中溶媒的流動方式主要有層流和湍流兩種[15-16]。層流方式是在流通池的錐形部放置1 mm的玻璃珠，從而使溶媒介質(zhì)在流通池內(nèi)均勻的流動，層流可以使被測樣品均勻釋放，不易產(chǎn)生突釋；湍流方式即不加入玻璃珠，樣品能夠產(chǎn)生突釋的效果，故此種流動方式一般適用于一些難溶性藥物的溶出度測定。層流方式能夠更加真實的模擬陰道環(huán)境，在本實驗中采用層流方式。

本文選擇苦參堿、兒茶素、表兒茶素、人參皂苷Re、鹽酸小檗堿作為評價消糜栓溶出度的指標性成分能夠客觀真實的反應藥物的溶出性能。實驗結(jié)果表明鹽酸小檗堿的溶出量較低，這可能是由于鹽酸小檗堿是一種異喹啉類生物堿，其在水中的溶解度比較小[17]。本實驗中，選擇了 30、120、240 min 3 個時間段的溶出量進行統(tǒng)計學分析，主要是因為30 min的溶出量能夠具有代表性的反映溶出開始時的溶出速率，120 min的溶出量則能夠反映溶出趨于完全時的溶出情況；240 min時的溶出量則反映了藥物整個溶出過程的最終溶出量。

表3 3種流速下消糜栓5種成分溶出量的單因素方差分析

實驗結(jié)果表明，流速對于測定消糜栓5種成分的溶出具有顯著的影響。流速是流通池法中一個及其重要的參數(shù)，故在每次實驗過程中應當校正流速以獲得良好的釋放曲線從而評價其釋放行為。本實驗中選擇的兩種溶出介質(zhì)水以及醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.5）對于苦參堿、鹽酸小檗堿的溶出具有顯著影響，對于其他3種成分不具有顯著影響，這可能與消糜栓的處方組成、主要成分的化學結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)有關[18]。因此在流通池法測定藥物的溶出度試驗中，應當根據(jù)藥物的處方特點、藥理活性等選擇具體的溶出介質(zhì)。