朱 健，武璐璐，張全書(shū)，王翔鵬，袁 林，向 陽(yáng)

(1. 湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院；2. 風(fēng)濕病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見(jiàn)的自身免疫性慢性炎癥性疾病，其病理特征為炎性細(xì)胞與滑膜細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)，導(dǎo)致多關(guān)節(jié)炎癥、滑膜增厚、骨與軟骨組織受損、關(guān)節(jié)破壞畸形，甚而多臟器損傷[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在RA治療方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，而中草藥的天然特性及其多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的綜合作用方式，使其在RA的治療方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。湖北楓楊(PterocaryahupehensisSkan)可解熱殺蟲(chóng)、祛風(fēng)除濕、消腫止痛，常用來(lái)治療風(fēng)濕麻木、寒濕骨痛、關(guān)節(jié)疼痛、跌打損傷[2]，是恩施民間常用的治療RA的土家藥。本實(shí)驗(yàn)主要觀察了湖北楓楊乙醇提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型的影響，初步探討了其可能的作用機(jī)制，為湖北楓楊應(yīng)用于臨床提供一定的理論實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)♂SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2011-0012。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品與試劑湖北楓楊由湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院中草藥標(biāo)本中心集中采購(gòu)，經(jīng)相關(guān)機(jī)構(gòu)鑒定為胡桃科(Juglandaceae)楓楊屬(PterocaryaKunth)植物的干燥莖皮；雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z3302042)；無(wú)水乙醇、冰醋酸(上海滬試國(guó)藥集團(tuán)股份有限公司)；牛Ⅱ型膠原(美國(guó)Chondrex公司)；弗氏完全佐劑(美國(guó)Sigma公司)；TUNEL試劑盒(瑞士Roche公司)；TNF-α、IL-1β試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；p-NF-κB p65、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax抗體(美國(guó)Abcam公司)；β-actin抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3儀器旋蒸儀、真空冷凍干燥機(jī)(瑞士Buchi公司)；電熱恒溫箱(美國(guó)GOLO-SIM公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；電子顯微鏡(日本Olympus公司)；低速離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；電泳槽、電轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；超靈敏化學(xué)發(fā)光成像分析儀(美國(guó)GE公司)。

2 方法

2.1湖北楓楊乙醇提取物的制備取湖北楓楊干燥莖皮1 kg，粉碎，用10倍體積75%乙醇浸泡24 h，后用超聲浸提40 min，反復(fù)提取5次，每次過(guò)濾取濾液，合并5次濾液，離心去渣，減壓濃縮后真空冷凍干燥，得湖北楓楊乙醇提取物200.11 g，使用時(shí)用蒸餾水配制成所需濃度。

2.2CIA模型的建立從60只適齡♂SD大鼠中隨機(jī)取出10只作為陰性對(duì)照組(N組)，其余大鼠用于建立CIA模型。將完全弗氏佐劑與用冰醋酸溶解后4 ℃過(guò)夜的牛Ⅱ型膠原，按1 ∶1比例在冰浴條件充分乳化，配制成混合乳劑。在大鼠右后足趾部、尾部、背部多點(diǎn)皮內(nèi)注射混合乳劑每只0.3 mL，陰性對(duì)照組在相同部位注射等體積的生理鹽水[3]。14 d后重復(fù)上述步驟。二次免疫3～7 d后，免疫組大鼠足趾腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯增加，膝關(guān)節(jié)滑膜增厚，同時(shí)伴大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，即CIA模型構(gòu)建成功。

2.3分組及給藥將二次免疫7 d后的50只大鼠，隨機(jī)分為模型組(M組)、陽(yáng)性對(duì)照雷公藤多苷組(TG組)、湖北楓楊乙醇提取物低(PL)、中(PM)、高(PH)劑量組。當(dāng)天灌胃給藥，陽(yáng)性對(duì)照組給予6.25 mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷(參考60 kg成人臨床常用劑量1 mg·kg-1·d-1，折算成等效大鼠劑量)，治療組分別給予0.42、0.84、1.68 g·kg-1·d-1的湖北楓楊乙醇提取物(低劑量參考60 kg成人臨床常用水煎液劑量0.33 g·kg-1·d-1乘以醇提物約20%的提取率后，折算成等效大鼠劑量，中、高劑量分別為低劑量的2倍、4倍)，陰性對(duì)照組、模型組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)灌胃28 d。

2.4指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1大鼠體質(zhì)量的測(cè)定 從第2次免疫d 7(給藥治療d 0)起，測(cè)量各組大鼠體質(zhì)量，每隔7 d觀察記錄1次。觀察各用藥組對(duì)CIA大鼠體質(zhì)量的影響。

2.4.2大鼠足跖腫脹度的測(cè)定 用水容積法測(cè)量每只大鼠左后足的容積，從第2次免疫d 7起，每隔7 d測(cè)量1次各組大鼠左后足容積。觀察各用藥組對(duì)CIA大鼠足腫脹度的影響。

2.4.3大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的測(cè)定 從第2次免疫d 7起，計(jì)算大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)，每隔7 d觀察記錄1次。大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)計(jì)算采取5級(jí)評(píng)分法：0分，關(guān)節(jié)無(wú)紅腫；1分，趾關(guān)節(jié)紅腫；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，踝關(guān)節(jié)和所有足爪腫脹、關(guān)節(jié)嚴(yán)重變形。大鼠所有關(guān)節(jié)炎指數(shù)之和即為每只大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)值，最高分值為16分。

2.4.4大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)學(xué)觀察 給藥28 d后，麻醉大鼠，心尖取血，取大鼠左后足膝關(guān)節(jié)滑膜，用4%的多聚甲醛溶液固定后脫鈣，乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，浸蠟包理，切片，進(jìn)行HE染色；同時(shí)左后足膝關(guān)節(jié)滑膜按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。顯微鏡下觀察、拍照，計(jì)算滑膜細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)。取右膝關(guān)節(jié)滑膜置-80 ℃冰箱備用。

2.4.5大鼠血清ALT、AST、BUN、SCr及TNF-α、IL-1β含量的測(cè)定 將取出的大鼠全血室溫靜置2 h后，3 500 r·min-1離心10 min，取上層血清，分裝。一部分用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠血清中ALT、AST、BUN、SCr的含量；另一部分按照相應(yīng)ELISA試劑盒，檢測(cè)各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β的含量。

2.4.6大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜中p-p65、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白檢測(cè) 冰上提取各組大鼠右膝關(guān)節(jié)滑膜總蛋白，蛋白上樣緩沖液變性后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，洗膜，分別加相應(yīng)一抗p-p65(1 ∶1 000)、cleaved caspase-3(1 ∶800)、Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶20 000)，室溫下在搖床上孵育2 h。洗膜后，加入ECL發(fā)光劑，用凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以內(nèi)參β-actin作對(duì)照，計(jì)算各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1湖北楓楊乙醇提取物對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響大鼠第1次免疫后開(kāi)始出現(xiàn)倦怠、食欲減退，隨之體質(zhì)量下降。如Fig 1所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量下降(P<0.05)；用藥后，各治療組大鼠體質(zhì)量較模型組增加(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物高劑量組大鼠體質(zhì)量增加較雷公藤多苷組明顯(P<0.05)。

Fig 1 Changes of body weight of rats in each

△P<0.05vsnormal group;**P<0.01vsmodel group;#P<0.05vsTG group

3.2湖北楓楊乙醇提取物對(duì)大鼠足跖腫脹度的影響如Fig 2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠足跖腫脹度明顯增加(P<0.05)，出現(xiàn)嚴(yán)重的紅腫甚至變形，足掌的寬度、厚度均明顯增加；與模型組比較，治療1周后，各用藥組大鼠足跖腫脹度明顯下降，并持續(xù)至用藥4周后(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物高劑量組足跖腫脹情況在用藥2周后下降，較雷公藤多苷組明顯(P<0.05)。

Fig 2 Changes of paw swelling degreeof rats in each

△P<0.05vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05vsTG group

3.3湖北楓楊乙醇提取物對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響如Fig 3所示，大鼠二次免疫后，四肢關(guān)節(jié)相繼出現(xiàn)腫脹、發(fā)紅，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，繼而出現(xiàn)皮膚潰爛、關(guān)節(jié)畸形等癥狀。與對(duì)照組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，各治療組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)在給藥后持續(xù)下降(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物高劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)較雷公藤多苷組下降明顯(P<0.05)。

Fig 3 Changes of arthritis indexof rats in each

△P<0.05vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05vsTG group

3.4湖北楓楊乙醇提取物對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜HE染色和TUNEL染色的影響大鼠滑膜HE染色顯示(Fig 4)，對(duì)照組膝關(guān)節(jié)滑膜無(wú)增生、突起，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組滑膜增生明顯，滑膜襯細(xì)胞分層增多、增厚，并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；雷公藤多苷組滑膜增生減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少；湖北楓楊乙醇提取物低劑量組滑膜增生有所改善，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)稍減；中劑量組滑膜增生明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少；高劑量組滑膜輕度增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。

Fig 4 HE staining of knee synovial membrane of rats in each group(×200)

A:Normal group; B: Model group; C: PL group; D: PM group; E: PH group; F: TG group. The arrows indicate the synovial tissue

經(jīng)TUNEL染色后，凋亡細(xì)胞呈棕色(陽(yáng)性細(xì)胞)，正常細(xì)胞呈藍(lán)色。大鼠滑膜TUNEL染色計(jì)數(shù)結(jié)果顯示(Fig 5)，模型組滑膜細(xì)胞有少量凋亡，凋亡指數(shù)與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性；各組大鼠凋亡指數(shù)顯示(Tab 1),與模型組比較，各用藥組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量皆增多，凋亡指數(shù)升高(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物高劑量組滑膜細(xì)胞凋亡指數(shù)高于雷公藤多苷組(P<0.05)。

Fig 5 TUNEL staining of knee synovial membrane of rats in each group(×200)

A: Normal group; B: Model group; C: PL group; D: PM group; E: PH group; F: TG group

Tab 1 Apoptotic index of each group of

**P<0.01vsmodel;#P<0.05vsTG

3.5湖北楓楊乙醇提取物對(duì)大鼠血清TNF-α和IL-1β含量的影響如Tab 2所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量明顯增加(P<0.05)；給藥后，各治療組血清中TNF-α、IL-1β含量較模型組下降(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物高劑量組血清中TNF-α、IL-1β含量較雷公藤多苷組下降較為明顯(P<0.05)。

3.6湖北楓楊乙醇提取物對(duì)大鼠血清ALT、AST、BUN和SCr水平的影響如Tab 3所示，與對(duì)照組比較，模型組血清ALT、AST、BUN、SCr水平增加(P<0.05)；湖北楓楊乙醇提取物低、中、高劑量組較模型組下降(P<0.05)；雷公藤多苷組與模型組相比差異無(wú)顯著性。

Tab 2 Changes of TNF-α and IL-1β inserum of rats in each

△P<0.05vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05vsTG

3.7湖北楓楊乙醇提取物對(duì)大鼠滑膜p-p65、cleavedcaspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響如Fig 6所示，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜中p-p65、Bcl-2表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；用藥后，各治療組滑膜內(nèi)p-p65、Bcl-2表達(dá)減少(P<0.01)，cleaved caspase-3、Bax表達(dá)增加(P<0.01)；與雷公藤多苷組比較，湖北楓楊高劑量組cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2改變明顯(P<0.05)。

3.8相關(guān)性分析如Tab 4所示，TNF-α、IL-1β分別與大鼠體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，與大鼠關(guān)節(jié)腫脹率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)呈正相關(guān)。

4 討論

目前，RA的病因病機(jī)尚未完全明確。RA的主要病理特點(diǎn)為促炎細(xì)胞因子的高水平分泌和病變關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)為炎癥的反復(fù)發(fā)作、滑膜增厚、血管翳形成和功能異常，最終引起骨和關(guān)節(jié)的病變[4]。

炎性反應(yīng)介質(zhì)的持續(xù)作用在RA的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用。TNF-α是在RA發(fā)病過(guò)程中起重要調(diào)控作用的細(xì)胞因子之一，有研究表明，在RA的活動(dòng)期和進(jìn)展期，TNF-α分泌水平增高[5]。TNF-α可增加趨化因子的合成、分泌，影響?zhàn)じ椒肿拥谋磉_(dá)，刺激成纖維細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素和膠原酶，刺激軟骨細(xì)胞分泌金屬蛋白酶，加重炎性反應(yīng)，促進(jìn)骨和關(guān)節(jié)的破壞[6]。IL-1β亦是一種重要的促炎細(xì)胞因子，可增強(qiáng)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的黏附性和趨化性[7]，使其在炎癥區(qū)域游走與聚集；亦可促進(jìn)前列腺素、金屬蛋白酶的合成和釋放，促進(jìn)滑膜細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的增殖[8]，在軟骨破壞和骨侵蝕中起著重要作用。另外，IL-1β還可調(diào)節(jié)多種炎癥因子的表達(dá)，協(xié)同促進(jìn)炎癥因子增加[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，湖北楓楊乙醇提取物可降低大鼠的足跖腫脹率和關(guān)節(jié)炎指數(shù)，增加大鼠體質(zhì)量，同時(shí)，大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量也下降，且TNF-α、IL-1β含量與足跖腫脹率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)呈正相關(guān)，與大鼠體質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明湖北楓楊乙醇提取物可能通過(guò)抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達(dá)，減輕CIA大鼠的炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到保護(hù)關(guān)節(jié)滑膜和軟骨的目的。

Tab 3 Changes of ALT, AST, BUN, and SCr in serum of rats in each

△P<0.05vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05vsTG

Fig 6 Changes of p-p65, cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2proteins in synovial membrane of rats in each

△P<0.05vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05vsTG group

Tab 4 Correlation analysis of various n=10)

*P<0.05vsbody weight;#P<0.05vsjoint swelling rate;△P<0.05vsAI

滑膜細(xì)胞的過(guò)度增殖活化是RA發(fā)病的重要基礎(chǔ)，成纖維滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)凋亡不足是其關(guān)鍵因素。正常情況下，F(xiàn)LS增殖與凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡中。當(dāng)RA機(jī)體內(nèi)微環(huán)境改變時(shí)，如在TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子刺激下，F(xiàn)LS出現(xiàn)凋亡缺陷，開(kāi)始異常增殖，呈腫瘤樣侵襲特性，同時(shí)又釋放大量細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶，繼而刺激滑膜細(xì)胞增殖、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成，侵蝕骨和關(guān)節(jié)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予湖北楓楊乙醇提取物治療后，大鼠滑膜細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡，滑膜增生減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，同時(shí)大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量降低。說(shuō)明湖北楓楊乙醇提取物可能通過(guò)抑制炎癥因子的釋放，促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡，抑制滑膜增生，從而改善RA的病情。研究表明，只有當(dāng)核因子NF-κB p65的活性被抑制時(shí)，TNF-α才發(fā)揮促凋亡作用[11]，而IL-1β亦可通過(guò)抑制NF-κB的活性來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。caspase-3作為細(xì)胞凋亡過(guò)程中的主要效應(yīng)因子，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)被激活，導(dǎo)致許多蛋白或激酶失活，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞周期阻滯及DNA修復(fù)異常，使細(xì)胞凋亡[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，湖北楓楊乙醇提取物治療組滑膜內(nèi)p-p65表達(dá)降低，cleaved caspase-3表達(dá)增加，說(shuō)明湖北楓楊乙醇提取物可能通過(guò)降低p-p65的釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，湖北楓楊乙醇提取物治療組滑膜內(nèi)Bcl-2表達(dá)減少，Bax表達(dá)增加，Bcl-2/Bax比值降低。Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，當(dāng)Bcl-2/Bax比值降低時(shí)，可使線粒體外膜通透性增加，細(xì)胞色素C等膜間隙蛋白釋放[14]，激活下游caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)凋亡。說(shuō)明湖北楓楊乙醇提取物可能通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組血清ALT、AST、BUN、SCr水平增加，說(shuō)明CIA模型對(duì)大鼠的肝臟和腎臟有一定的損傷。湖北楓楊乙醇提取物低、中、高劑量組較模型組下降，說(shuō)明湖北楓楊乙醇提取物可改善CIA模型對(duì)肝、腎的損傷。雷公藤多苷組血清ALT、AST、BUN、SCr水平與模型組差異無(wú)顯著性。另有研究報(bào)道，雷公藤多苷可對(duì)肝、腎有一定程度的損傷[15]。由此可見(jiàn)，在保護(hù)肝、腎方面，湖北楓楊乙醇提取物優(yōu)于雷公藤多苷。

綜上所述，湖北楓楊乙醇提取物對(duì)SD大鼠CIA模型有很好的治療效果，并可通過(guò)調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及p-p65、凋亡蛋白cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)，起到很好的抗炎和誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡的作用。而湖北楓楊乙醇提取物中何種成分影響上述細(xì)胞因子和蛋白的傳導(dǎo)，具體通過(guò)哪種機(jī)制，以及是否還通過(guò)其他途徑達(dá)到抗炎、促凋亡目的，我們將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中研究和探索。