付春利

（開平市中心醫(yī)院胸外科 廣東 開平 529300）

雖然目前在肺癌的診斷和治療中已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，如靶向治療和免疫治療等，但患者的長期預(yù)后仍然不理想，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肺癌相關(guān)死亡的主要原因[1]。因此，我們迫切需要深入研究肺癌發(fā)生發(fā)展的潛在分子機(jī)制，并探索新的生物標(biāo)志物和治療方式供臨床轉(zhuǎn)化。

長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）屬于非蛋白質(zhì)編碼核苷酸，是一類新的快速出現(xiàn)的轉(zhuǎn)路子大家族，其長度大多超過200個(gè)核苷酸，其不但可以影響正常生理過程，而且也參與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，目前已經(jīng)引起了人們的極大關(guān)注并成為了腫瘤領(lǐng)域深入研究的熱點(diǎn)之一[2]。目前已經(jīng)有部分lncRNAs被證明通過在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和表觀遺傳水平等層面參與了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程。并且，有研究表明，靶向癌癥或腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNAs可以阻斷癌細(xì)胞的增值和存活、逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥和轉(zhuǎn)移[2-3]。因此，lncRNAs對(duì)癌癥的發(fā)生和疾病進(jìn)展至關(guān)重要，有望成為新的治療靶點(diǎn)。lncRNA PCAT19是lncRNAs中的一個(gè)重要成員，其在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)，且其高表達(dá)與腫瘤的發(fā)展及患者的不良預(yù)后存在明顯的相關(guān)性[3]，然而其在肺癌中的作用至今未見報(bào)道。本研究為了探討lncRNAs在肺癌中的臨床應(yīng)用價(jià)值，通過沉默lncRNA PCAT19在人肺癌細(xì)胞株A549中的表達(dá)，探討lncRNA PCAT19表達(dá)下調(diào)對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549的增值與侵襲的作用。

1.資料與方法

1.1 主要材料和試劑

control-shRNA和lncRNA PCAT19-shRNA通過英偉創(chuàng)津公司設(shè)計(jì)并構(gòu)建，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000從美國英偉創(chuàng)津公司購入，MTT粉通過美國西格瑪公司購入，RNA抽提試劑盒購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，Transwell小室從美國Becton Dickinson公司購入。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法

首先將生長狀態(tài)良好的肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)后分為兩組：研究組和對(duì)照組。待培養(yǎng)的細(xì)胞密度達(dá)50%～60%左右后開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染開始前分別用不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)液稀釋100pmol候選轉(zhuǎn)染質(zhì)粒與5μl的轉(zhuǎn)染試劑lipofectamin2000，將其兩者混勻后，放在室溫孵育約5min后開始轉(zhuǎn)染。對(duì)照組轉(zhuǎn)染controlshRNA，研究組轉(zhuǎn)染lncRNA PCAT19-shRNA，約48h后再收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖（MTT法檢測(cè)）

同時(shí)消化上述兩組細(xì)胞，在96孔板中分別加入200μl約5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞約48h后取出，每孔加20μl MTT液，再培養(yǎng)約4h后取出，每孔中再加入150μl DMSO，低速振蕩10min后檢測(cè)吸光值。選擇酶標(biāo)儀波長為570nm后測(cè)定各孔吸光值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

分別從上述兩組細(xì)胞（研究組和對(duì)照組）中吸取100ul（1×105個(gè)細(xì)胞/ml）的細(xì)胞懸液至transwell小室的上室，在下室中加入RPMI-1640培養(yǎng)液500μL（含10%胎牛血清），將其放在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36h后，擦棄小室中上層未穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞，用1X PBS液輕洗1～3遍，之后再用4%的多聚甲醛將transwell小室固定，待其結(jié)晶祡染色后再用1X PBS液反復(fù)沖洗，倒置，晾干。最后使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的計(jì)數(shù)（取平均值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究所有數(shù)據(jù)均采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以表示。組間采用雙側(cè)t檢驗(yàn)比較分析。當(dāng)P＜0.05時(shí)，為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 研究組A549細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PCAT19的表達(dá)水平明顯下調(diào)

通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，研究組A549細(xì)胞中l(wèi)ncRNA PCAT19的mRNA表達(dá)量為（0.421±0.030），與對(duì)照組（1.116±0.078）進(jìn)行比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.036，P＜0.01），說明通過shRNA可以減低lncRNA PCAT19的在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)。

2.2 研究組A549細(xì)胞的增殖能力明顯降低

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組的A549細(xì)胞的OD值為0.719±0.065，而研究組的A549細(xì)胞的OD值0.542±0.029，兩組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.242，P＜0.01），結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，研究組A549細(xì)胞的增值能力明顯降低。

2.3 研究組A549細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱

通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，研究組穿過基質(zhì)膠的A549細(xì)胞數(shù)量為（71.2±9.1），而對(duì)照組穿過基質(zhì)膠的A549細(xì)胞數(shù)量達(dá)（149.6±12.8），兩組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.813，P＜0.01）。結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，研究組A549細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱。

3.討論

我們?cè)诜伟┘?xì)胞中通過shRNA敲減沉默lncRNA PCAT19的表達(dá)量，可以抑制肺癌細(xì)胞的增值和侵襲作用。徐帥等人[4]發(fā)現(xiàn)lncRNA PCAT19在喉癌組織中的表達(dá)較癌旁組織中明顯升高，且其在晚期患者的腫瘤組織中表達(dá)亦升高，且與患者預(yù)后呈正相關(guān)；lncRNA PCAT19亦可通過PCAT19/miR-182/PDK4軸誘發(fā)Warburg效應(yīng)而促進(jìn)喉癌的增值與侵襲。另外，lncRNA PCAT19也可以靶向結(jié)合HNRNPAB促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[3]。這些結(jié)果均表明，lncRNA PCAT19是促進(jìn)腫瘤增值和惡性進(jìn)展的因子。

近年來lncRNAs在人類癌癥中的生物學(xué)功能引起了人們的廣泛關(guān)注，其在腫瘤中的差異性表達(dá)不但參與了腫瘤的發(fā)生，也可以作為腫瘤療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物指導(dǎo)臨床決策。lncRNA DSCAMAS1和MIR31HG不僅可通過靶基因分別調(diào)控肺癌細(xì)胞的進(jìn)展，還可預(yù)測(cè)腫瘤的預(yù)后[5-6]。然而，我們未檢測(cè)lncRNA PCAT19在肺癌組織中的表達(dá)，無法評(píng)估其預(yù)后作用，因此，深入研究肺癌患者組織標(biāo)本中l(wèi)ncRNA PCAT19的表達(dá)和生物學(xué)作用及其可能的分子機(jī)制，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。