張敏娜，張一兵綜述，王光輝，鐘 鳴審校

腦血管疾病是全球面臨的首要健康問題，缺血性腦卒(ischemic stroke)中發(fā)病率、致殘率和死亡率一直居高不下。缺血性腦卒的核心病變是致血管內(nèi)部空間變窄時甚至封閉血管，缺氧缺糖 (oxygen-glucose deprivation，OGD)引發(fā)炎性損傷、組織壞死和細胞凋亡的發(fā)生[1]。溶栓/切除血栓的臨床治療策略由于治療時間窗狹窄難以達到滿意的治療效果，因此開發(fā)缺血性腦卒中精準(zhǔn)治療新策略勢在必行。近年來研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)及骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow stem cells,BMCs)等通過增殖分化和遷移、改善受損區(qū)細胞生存微環(huán)境、重建受損區(qū)域神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)、最大限度的恢復(fù)缺失的神經(jīng)功能[2,3]。近年來干細胞移植治療腦血管疾病的研究主要集中在神經(jīng)干細胞聯(lián)合移植、干細胞納米材料傳遞體構(gòu)建、移植后實時監(jiān)測細胞增殖、微小RNA(miroRNA)對神經(jīng)干細胞的調(diào)控和基因修飾后移植神經(jīng)干細胞等方面， NSCs移植治療缺血性腦卒中的作用和機制為臨床精準(zhǔn)治療提供有益參考。

1 移植NSCs對缺血性腦卒中治療作用與意義

腦卒中動物模型常用大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)及缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury,I/R)模型，體外擴增和移植的方式引入外源性NSCs、BMCs等具有增殖分化能力的干細胞，也可以激活腦室管膜室下區(qū)SVA和海馬齒狀回顆粒層下區(qū)SGZ的成體干細胞aNSCs(SVA和SGZ為aNSCs較為集中部位)[4,5]，NSCs以及其神經(jīng)前體細胞(部分源于BMCs)的誘導(dǎo)激活增殖分化和遷移重構(gòu)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)為修復(fù)受損腦區(qū)帶來了新的治療前景[6,7]。通過NSCs自我更新、多向分化能力，內(nèi)分泌、抗炎、抗損傷等作用，有利于損失的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的重新構(gòu)建，具體治療作用包括組織修復(fù)(誘導(dǎo)分化形成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞等)、神經(jīng)突觸重構(gòu)(誘導(dǎo)βIII神經(jīng)微絲蛋白的表達和延伸)、神經(jīng)內(nèi)分泌(神經(jīng)營養(yǎng)因子)、激活損傷區(qū)域附近存在的NSCs和神經(jīng)前體細胞、誘導(dǎo)微血管發(fā)生、自噬功能調(diào)節(jié)、外泌體的形成與調(diào)控、維持細胞增殖內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等[8,9]。

2 NSCs移植治療缺血性腦卒中研究

2.1 聯(lián)合移植治療 盡管成人神經(jīng)干細胞原位激活參與修復(fù)發(fā)揮到一定作用，但是距離理想的修復(fù)還有一段很長的研究之路要走，不同類型的干細胞，如NSCs、BMCs、PC12細胞、胚胎干細胞、牙髓干細胞、以及人誘導(dǎo)多能干細胞(hi-PSC)等衍生的神經(jīng)干細胞/神經(jīng)祖細胞作為缺血性卒中的治療的良好儲備細胞[10,11]。傳統(tǒng)NSCs移植的主要方式包括局部注射、動脈或靜脈注射、腦室腦脊液注射等途徑，各有利弊，近年來NSCs移植方式/方法也在不斷的改進和更新，突破了單一種類細胞移植的局限，尤其是移植方式的改變?nèi)缏?lián)合特定的條件移植、聯(lián)合特殊的細胞移植、聯(lián)合藥物等移植為移植后細胞成活創(chuàng)造了良好的條件。胚胎源性NSCs+腦血管內(nèi)皮細胞共培育后同時移植，借助內(nèi)皮細胞的分泌作用和周細胞(pericyte)成血管作用發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、突觸重塑、調(diào)節(jié)細胞自噬功能[12]。NSCs聯(lián)合亞低溫療法(33 ℃)，借助于低溫條件減少細胞代謝、增加對缺血缺氧損傷的耐受能力，結(jié)果顯示缺血后梗死面積減小伴有炎性損傷明顯減輕[13]。突破血腦屏障是血液途徑移植干細胞到達腦區(qū)研究方向，甘露醇聯(lián)合替莫唑胺(Temozolomide)可以改變腦血液滲透壓的同時，增加血腦屏障的通透性，所以NSCs+甘露醇+替莫唑胺靜脈注射到慢性腦卒中動物模型后明顯增加NSCs腦內(nèi)遞送[14]。綜合上述研究，與單純NSCs移植相比，增加病變周圍區(qū)域的溴脫氧尿苷(活躍增殖細胞聚集區(qū)域)、雙皮質(zhì)素(新生神經(jīng)元所在區(qū)域)和Reca-1陽性細胞(血管內(nèi)皮細胞)的表達，聯(lián)合治療更有助于改善行為缺陷，其機制可能涉及增加進入腦缺血區(qū)干細胞的數(shù)量、改善神經(jīng)再生和血管生成。

2.2 納米材料作為移植傳遞體的治療 納米顆粒粒徑小(1～100 nm)，表面體積/體積比相對大，有利于細胞或分子(藥物、抗體)附著，納米技術(shù)提高藥物生物利用度，增加藥物的特異性治療作用，降低了藥物的不良反應(yīng)[15]。納米材料作為NSCs移植的傳遞體，為提高移植后細胞生存率和改善神經(jīng)功能方面作用突出，磁性納米材料的導(dǎo)入可以在治療中進行實時監(jiān)測效果，成為細胞移植治療的新亮點。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞不良再生能力干細胞在腦損傷中的治療效果，尤其持續(xù)的炎癥反應(yīng)、缺乏結(jié)構(gòu)支持和營養(yǎng)因子缺乏等因素抑制了細胞的整合和長期存活。硫酸化糖胺聚糖基聚電解質(zhì)復(fù)合納米顆粒的納米雜化水凝膠可以模擬腦細胞外基質(zhì)，并控制基質(zhì)衍生因子SDF-1α和bFGF的遞送。bFGF對基質(zhì)金屬蛋白酶的反應(yīng)，用于募集內(nèi)源性NSCs和調(diào)節(jié)其細胞增殖和發(fā)育。利用PCN表面靜電隔離技術(shù)釋放生物活性因子，體外擴增SDF-1α和bFGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以調(diào)節(jié)NSCs。在體內(nèi)缺血性卒中模型中，這些因素通過增強神經(jīng)發(fā)生和血管生成來促進神經(jīng)行為恢復(fù)[16]。缺血性腦卒中治療最關(guān)鍵的是恢復(fù)神經(jīng)回路，其中神經(jīng)元功能重建起著中心作用。損傷微環(huán)境中由于髓鞘相關(guān)抑制因子結(jié)合Nogo-66受體(NgR)導(dǎo)致NSCs向神經(jīng)元分化不良，嚴重影響了治療效果。將鈷超順磁性氧化鐵納米粒子和靶向NgR基因的siRNA編碼入NSCs的納米聚合物，通過沉默NgR基因來指導(dǎo)NSC的神經(jīng)元分化，更有意義的是可以通過磁共振成像實時無創(chuàng)地監(jiān)測NSCs的遷移狀況，集治療與實時監(jiān)測于一體。結(jié)果顯示體外實驗結(jié)果NSCs分化為神經(jīng)元的比例可由3%左右提高到37%左右；體內(nèi)實驗顯示將經(jīng)過鈷超順磁性氧化鐵納米粒子和靶向NgR基因的siRNA編碼入NSCs處理過的神經(jīng)干細胞直接移植到腦梗死動物模型，神經(jīng)元的比例也可由4%左右(對照組)提高到27%左右(鈷超順磁性氧化鐵納米粒子組)，缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)得到改善[17]。

2.3 基因修飾治療 基因修飾處理后的神經(jīng)干細胞具有了更強的增殖分化能力和促進血管增生改善微環(huán)境作用，缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)、GDNF、NT-3和bFGF等基因修飾的NSCs移植治療研究取得很大進步。HIF在缺氧環(huán)境中參與基因轉(zhuǎn)錄，HIF-1由HIF-1α(120 kD)和HIF-1β(91～94 kD)兩個亞單位組成的異源二聚體。經(jīng)重組腺病毒構(gòu)建AD-HIF-1α載體,感染NSCs后經(jīng)腦室內(nèi)移植進入MCAO動物。4 w后HIF-1α的免疫印跡和免疫組化結(jié)果均顯示Nestin陽性移植細胞以及神經(jīng)元(NSE陽性)和星形膠質(zhì)細胞(GFAP陽性)數(shù)量明顯增加。行為學(xué)檢測結(jié)果標(biāo)明動物運動功能和認知功能改善明顯。缺血區(qū)Ⅷ因子陽性細胞(血管內(nèi)皮細胞)數(shù)增加，表明HIF-1α的表達同時促進血管生成[18]。

GDNF促進軸突再生。GDNF/NSCs更能顯著抑制腦炎癥、提高髓鞘密度的。GDNF/NSCs的存活率明顯高于移植的NSCs。移植的GDNF/NSCs分化成更多的神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞。此外，在大鼠GDNF/神經(jīng)少突膠質(zhì)細胞mRNA的表達與大鼠神經(jīng)干細胞顯著增加[19]。聯(lián)合移植和基因修飾GDNF基因修飾胎鼠中腦外側(cè)區(qū)中腦來源神經(jīng)干細胞mNSC，培養(yǎng)5 d。與PBS注射和GFP基因修飾的mNSCs移植相比，GDNF基因修飾中腦來源的是神經(jīng)干細胞mNSCs移植后56 d，大鼠腦內(nèi)移植細胞數(shù)量增多，移植組檢測到更多分化的多巴胺能神經(jīng)元[20]。改善中腦損傷引發(fā)的退行性改變分子機制尚需進一步闡明。NT-3基因修飾的NSCs聯(lián)合膠原蛋白硫酸肝素支架移植可顯著改善腦出血大鼠運動功能。移植的神經(jīng)干細胞具有較好的存活、遷移和分化能力[21]。MCAO大鼠腹腔注射改良bFGF基因修飾的C17.2NSCs(5×106/200 μl)于MCAO后第7天和第28天進行組織學(xué)分析。C172細胞在腦內(nèi)的存活、遷移、增殖和分化均得到改善[22]。

3 microRNA在NSCs修復(fù)缺血性腦卒中治療中的調(diào)控作用

microRNA為1993年發(fā)現(xiàn)的一類小分子非編碼RNA(21～25個核苷酸),通過斷裂靶標(biāo)mRNA和抑制翻譯過程參與基因表達的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄過程中與基因的非編碼區(qū)的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制基因的表達,另外microRNA為一種作為表觀遺傳因子，參與胚胎發(fā)育過程的時間和空間順序的生物鐘調(diào)節(jié)、細胞調(diào)亡、各類型干細胞增殖分裂和分化，神經(jīng)生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)miroRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度富集，參與神經(jīng)元分化和突觸形成過程[23,24]。與NSCs及BMCs分化為神經(jīng)細胞相關(guān)的有miR134、miR145、miR124和miR126在神經(jīng)干細胞移植治療MACO中的調(diào)控作用也是研究熱點問題。Chi等[25]發(fā)現(xiàn)MACO經(jīng)缺氧缺糖處理后，BMCs miR134水平下降，而incaspase-8水平升高，通過降低caspase-8的表達和活性而顯著抑制細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)表達caspase-8小干擾RNA敲除caspase-8可減少少突膠質(zhì)細胞凋亡，實驗結(jié)果表明，源于骨髓間充質(zhì)干細胞的神經(jīng)前體細胞外體通過負性調(diào)節(jié)caspase-8依賴的凋亡途徑，miR134抑制少突膠質(zhì)細胞的凋亡。定量逆轉(zhuǎn)錄酶實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR145相關(guān)mRNA通路，發(fā)現(xiàn)miR145、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和p38 mRNA在大鼠NSCs中的表達呈時間依賴性。Western blot顯示miR145的過度表達促進了NSCs中MAPK通路相關(guān)mRNA和蛋白的表達，而miR145的表達抑制了MAPK通路的表達。miR145在NSCs中的過度表達促進了細胞周期素D1、巢蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶和膠質(zhì)纖維酸性蛋白蛋白的上調(diào)，增強了NSCs的活性，促進了細胞增殖和分化，抑制了細胞凋亡和裂解caspase-3的表達。移植后大鼠NSCs過度表達miR145后，行走能力和神經(jīng)功能恢復(fù)迅速，皮質(zhì)中產(chǎn)生更多神經(jīng)元。miR145通過靶向MAPK通路保護腦缺血大鼠神經(jīng)干細胞的功能[26]。miR 124納米顆粒(NPs)在缺氧缺糖后降低了細胞死亡并改善了室下區(qū)神經(jīng)干細胞培養(yǎng)的神經(jīng)元分化，進一步深入研究，換用血栓形成誘導(dǎo)的永久性局灶性腦缺血后立即靜脈注射miR 124納米顆粒在PT后14 d,免疫學(xué)發(fā)現(xiàn)SVZ中5-溴-2’-脫氧尿苷(BrdU)和雙皮質(zhì)素/BrdU陽性細胞的數(shù)量變化不明顯，即SVZ中神經(jīng)干細胞/神經(jīng)祖細胞增殖未見影響。但是miR124NPS能夠在卒中后第2天特異性地增加IL-6水平，起到明顯改善炎性微環(huán)境的作用[27]。相似的研究還發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后miR126在促進神經(jīng)干細胞生長增殖的同時,通過負向調(diào)節(jié)HOXA9表達提高神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化,從而促進小鼠運動功能修復(fù)[28]。血管內(nèi)皮細胞的生成和調(diào)節(jié)也是一個神經(jīng)組織修復(fù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，表達miR126的內(nèi)皮前體細胞(endothelial progenitor cell，EPCs)被注入腦卒中小鼠，微血管密度增加，神經(jīng)功能評分和梗死體積減少，進一步研究顯示miR126通過MIR 126/SDF 1/CXCR7信號通路促進EPCs的遷移[29]。

4 思考與展望

成年內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的作用可能是以內(nèi)分泌功能調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境為主，增殖分化功能相對較弱，激活信號通路機制方面有待于進一步深入研究。相比之下外源性神經(jīng)干細胞移植治療前景廣闊，盡管目前存在倫理的問題、免疫排斥反應(yīng)甚至誘發(fā)腦部腫瘤的風(fēng)險等[30]，隨著神經(jīng)干細胞生存環(huán)境的逐漸改善，特別是近年來基因組學(xué)的研究深入，包括microRNA的調(diào)控作用研究、NSCs基因修飾研究和基因編輯技術(shù)精確調(diào)控基因表達研究等，加之納米技術(shù)磁共振成像的應(yīng)用實現(xiàn)了對NSCs移植位置及分布實時監(jiān)控和生長發(fā)育動態(tài)的追蹤，為NSCs精準(zhǔn)治療缺血性腦卒中創(chuàng)造了有利的條件。