羅明 張匯征 嚴(yán)曉峰 陳耀凱 黃正谷 周刊 李同心 李俊剛 王靜 廖傳玉

耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的治療療程長，費(fèi)用高，治愈率僅為55%左右，而廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的治愈率更是低至34%[1]。惡唑烷酮類藥物是一類全新合成的抗菌藥物，利奈唑胺(Lzd)作為第一種上市的惡唑烷酮類抗生素，已被WHO列為治療MDR-TB的A組藥物[2-3]。特地唑胺(Tzd)作為第二代惡唑烷酮類藥物，雖已有研究表明其不僅對革蘭陽性菌(包括分枝桿菌)表現(xiàn)出了很好的抗菌活性，而且對Lzd敏感性降低的病原菌仍有很好的效果[4]，但目前尚未用于結(jié)核病的治療。筆者通過檢測40株MDR-MTB臨床分離株對Lzd和Tzd的敏感性，以初步了解MDR-MTB菌株對這兩種藥物的敏感性差異，為今后將Tzd用于結(jié)核病的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)支持。

材料和方法

1.菌株來源及菌種鑒定：采用簡單隨機(jī)抽樣法中的直接抽選法從重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心中心實(shí)驗(yàn)室2018年1—12月間培養(yǎng)分離并經(jīng)藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)鑒定為MDR-MTB的菌株中選取40株。結(jié)核分枝桿菌H37Rv(ATCC27294)標(biāo)準(zhǔn)菌株由中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

2.試劑和儀器：中性羅氏培養(yǎng)基和結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測試劑盒(比例法)由珠海銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司生產(chǎn)。Lzd、Tzd原藥藥粉由美國MCE公司生產(chǎn)。7H9肉湯培養(yǎng)基、油酸-白蛋白-葡萄糖-過氧化氫酶(OADC)增菌液購自美國BD公司。吐溫80及二甲基亞砜(DMSO)均購自美國 Sigma 公司。

3.比例法藥敏試驗(yàn)：參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]，對分枝桿菌陽性培養(yǎng)物進(jìn)行利福平(R，40 μg/ml)、異煙肼(H，0.2 μg/ml)、阿米卡星(Am，30 μg/ml)、卷曲霉素(Cm，40 μg/ml)、左氧氟沙星(Lfx，2 μg/ml)等抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)，耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5-6]。

4.最小抑菌濃度(MIC)法藥敏檢測：采用MIC檢測耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDR-MTB)臨床分離株對Lzd和Tzd的敏感性。按照文獻(xiàn)[5]操作，藥物濃度均倍比稀釋設(shè)置為0.030～16.000 mg/L的10個(gè)梯度[5]。刮取羅氏培養(yǎng)基上處于生長對數(shù)期的培養(yǎng)物，經(jīng)研磨分散重懸后，用7H9培養(yǎng)基配成1個(gè)麥?zhǔn)蠞舛热芤?，?∶10稀釋至含10%OADC的7H9培養(yǎng)基中。在制備好的藥敏平板每孔加入稀釋后的菌液100 μl，37 ℃恒溫培養(yǎng)7 d。每孔加入20 μl刃天青顯色液，再在37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察顯色讀取MIC，完全沒有變色的最小藥物濃度即為該菌株對這種藥物的MIC[5, 7]。

5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料為偏態(tài)分布，以“中位數(shù)(四分位數(shù))”表示；計(jì)數(shù)資料以“率(%)”表示；Lzd與Tzd對菌株MIC之間差異的比較采用Wilcoxon配對設(shè)計(jì)符號秩和檢驗(yàn)，Lzd和Tzd對不同耐藥類型菌株MIC間差異的比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Lzd和Tzd對MDR-MTB的MIC檢測結(jié)果： Lzd對MDR-MTB的MIC范圍在0.250～2.000 mg/L，中位數(shù)(四分位數(shù))為0.500(0.500，1.000) mg/L，其中87.5%(35/40)的菌株MIC處于0.500～1.000 mg/L；Tzd對MDR-MTB的MIC范圍在0.060～1.000 mg/L，中位數(shù)(四分位數(shù))為0.250(0.250，0.250) mg/L，其中87.5%(35/40)的菌株MIC處于0.125～0.250 mg/L。Lzd對MDR-MTB的MIC50和MIC90分別為0.500、1.000 mg/L；Tzd對MDR-MTB的MIC50和MIC90均為0.250 mg/L。Tzd的MIC明顯小于Lzd的MIC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-5.51，P<0.001)。97.5%(39/40)的菌株Lzd的MIC大于Tzd的MIC，僅1株菌對2種藥物的MIC相同，均為1.000 mg/L。1株菌對Lzd耐藥(MIC=2.000 mg/L)，其Tzd的MIC為0.500 mg/L。

2.Lzd和Tzd與其他藥物的交叉耐藥性：參照比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果，40株MDR-MTB臨床分離株按對Lfx、Am和Cm的不同耐藥譜可分為13株MDR-MTB，20株前廣泛耐藥結(jié)核(pre-XDR-MTB)和7株XDR-MTB。Lzd對MDR-MTB、pre-XDR-MTB和XDR-MTB的MIC的中位數(shù)(四分位數(shù))均為0.500(0.500，1.000) mg/L。Tzd對MDR-MTB、pre-XDR-MTB和XDR-MTB的MIC的中位數(shù)(四分位數(shù))均為0.250(0.250，0.250) mg/L。Lzd和Tzd對不同耐藥類型菌株的MIC差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Lzd：H=0.84，P=0.659；Tzd：H=0.59，P=0.746)。

討 論

MDR-TB的出現(xiàn)和傳播，極大地阻礙了全世界控制結(jié)核病的進(jìn)程。中國是結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的雙重高負(fù)擔(dān)國家之一，WHO[1]估算在2017年我國約有88.9萬例新發(fā)結(jié)核病患者，其中有5.8萬例為MDR-TB或耐利福平結(jié)核病(rifampin-resistant tuberculosis，RR-TB)。由于新的抗結(jié)核藥物的缺乏，使得MDR-TB的治療極為困難，而發(fā)掘現(xiàn)有藥物的抗結(jié)核活性并用于臨床成為一條便捷的途徑。

惡唑烷酮是一類人工合成的抗生素，表現(xiàn)出很好的抗分枝桿菌活性，其作用機(jī)制為與核糖體50S亞基結(jié)合，阻止了70S起始復(fù)合物的形成，從而在翻譯的早期階段抑制了細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成[3]。

在本研究中，通過MIC法檢測Lzd和Tzd的抗結(jié)核活性，兩種藥物均表現(xiàn)出了很好的效果。在40株MDR-MTB中，僅有1株菌對Lzd耐藥，Tzd對所有菌株的MIC均低于美國臨床標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的Lzd耐藥折點(diǎn)(>1 mg/L)[8]。Lzd對MDR-MTB臨床分離株的MIC多處于0.500～1.000 mg/L，略高于其他研究報(bào)道的 0.250～0.500 mg/L的結(jié)果[9-11]；Tzd對MDR-MTB臨床分離株的MIC多處于0.125～0.250 mg/L，與廖傳玉等[12]及Ruiz等[13]的研究結(jié)果一致。這種不同表現(xiàn)是否由于流行菌株譜系差異所造成，尚需進(jìn)一步研究。

在本研究中，Lzd對MDR-MTB的MIC50和MIC90分別為0.500、1.000 mg/L；Tzd對MDR-MTB的MIC50和MIC90均為0.250 mg/L，提示Tzd相比Lzd具有更好的抗結(jié)核效果，與Ruiz等[13]研究結(jié)果一致。結(jié)果也顯示，即使是對Lzd耐藥的1株菌株，其Tzd的MIC仍小于Lzd的1 mg/L的耐藥折點(diǎn)，說明即使是對Lzd耐藥的菌株，對Tzd仍可能是敏感的，這與Ruiz等[13]研究結(jié)果一致。同時(shí)我們也注意到，有一株菌株兩種藥物的MIC相同，提示對于部分菌株來說，Tzd的效果并不一定好于Lzd。本研究還顯示，Lzd和Tzd對MDR-MTB、pre-XDR-MTB和XDR-MTB的MIC沒有差異，這與文獻(xiàn)[12-14]研究結(jié)果一致，提示目前惡唑烷酮類藥物敏感性與其他藥物無關(guān)，在制定MDR-TB治療方案時(shí)，其他藥物的藥敏結(jié)果對惡唑烷酮類藥物的選用不具有參考價(jià)值。

本研究存在一定局限，即納入的樣本量較小且為非多中心研究。但本次研究結(jié)果初步明確了Lzd和Tzd兩種惡唑烷酮類藥物對MDR-MTB的MIC分布。結(jié)果表明，Lzd和Tzd對MDR-MTB菌株均有較好的殺菌效果，Tzd具有較Lzd更好的抗結(jié)核效果，而且對Lzd耐藥的菌株對Tzd仍可能是敏感的。Tzd已展現(xiàn)出了作為抗結(jié)核藥物的良好潛力，下一步仍需要多中心、大樣本的臨床研究，以進(jìn)一步明確其對耐藥結(jié)核病的有效性。