李欽玲 陳玉乾

摘要：采用微波輻射提取法對藏藥唐古特烏頭中的總生物堿進行提取，并用紫外分光光度法測定唐古特烏頭提取物中總生物堿的含量，用L9（34）正交試驗設(shè)計方法對提取工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明，微波輻射提取唐古特烏頭中總生物堿的最佳工藝條件如下：料液比為1 g ∶15 mL，浸泡時間為2 h，提取時間為15 min，提取溫度為40 ℃。在最佳工藝條件下，提取液中的生物堿含量最高，平均提取率為1.014%，表明該提取工藝耗時短，效率高，穩(wěn)定可行。

關(guān)鍵詞：唐古特烏頭;生物堿;正交試驗設(shè)計;微波輻射法

中圖分類號： R284文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）21-0260-03

收稿日期：2019-04-06

基金項目：教育部春暉計劃（編號：2010070）。

作者簡介：李欽玲（1962—），女，山西襄汾人，碩士，教授，研究方向為天然有機化學。E-mail：qhmdlql@126.com。

藏藥唐古特烏頭[Aconitum tanguticu（Maxmi.）Stapf]為毛茛科植物，多分布在青海、甘肅甘南、四川藏區(qū)等海拔為3 200～4 200 m 的高山草地或山頂多石礫處[1]。唐古特烏頭又稱甘青烏頭，藏藥名為榜噶，具有清熱解毒、生肌收口、燥濕等功效，多用于治療肝熱、膽熱、肺熱、肝炎、肺炎、胃腸炎以及瘍瘡、蛇蝎咬傷等[2-3]。據(jù)報道，唐古特烏頭中的主要生物堿成分為毒性較小的內(nèi)酯型二萜生物堿[4-6]，具有廣泛的藥用價值。近年來，對唐古特烏頭抗病毒、抗炎作用的研究均有報道[7-9]，哈文秀等做了唐古特烏頭中多糖的提取研究[10]，但是對其生物堿提取工藝的研究少見報道。

本試驗采用微波輻射法對藏藥唐古特烏頭干燥全草的生物堿進行提取，用紫外分光光度法測定其含量，通過正交試驗設(shè)計方法對其提取工藝進行研究，旨在獲得唐古特烏頭總生物堿的最佳提取工藝條件，在此基礎(chǔ)上建立簡單快捷的檢測手段，為開發(fā)和利用特色藥物、提取和分離該種植物的有效成分提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

本試驗所用藥材于2016年采自青海互助北山林場，經(jīng)青海民族大學藥學院藏藥專家毛繼組老先生鑒定為毛茛科烏頭屬植物唐古特烏頭[Aconitum tanguticu（Maxmi.）Stapf]全草;生物堿對照品，由青海民族大學藥學院中藏藥研究室提供;主要試劑為95%乙醇[分析純（AR）]、三氯甲烷（AR）、鹽酸（AR）、氨水（AR），試驗用水為蒸餾水。

1.2儀器設(shè)備

752N型紫外-可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）;XH-100A微波催化合成/萃取儀（北京祥鴿科技發(fā)展有限公司）;FZ102微型植物試樣粉碎機（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）;FA2204型電子分析天平（上海安亭電子儀器廠）;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;SHZ-DC（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪華儀器有限公司）。

1.3試驗方法

1.3.1樣品的處理取干燥的唐古特烏頭全草，去雜質(zhì)、干燥、粉碎后備用。

1.3.2樣品溶液的制備及檢驗準確稱取5.00 g粉碎后的唐古特烏頭，用75 mL 95%乙醇浸泡4 h，再用微波萃取儀提取3次，每次15 min，合并萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇得浸膏。往浸膏內(nèi)加入2% HCl溶液使之充分溶解，減壓抽濾，重復操作2～3次。合并濾液，用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至6～7，加活性炭脫色，用三氯甲烷萃取3次，再將pH值調(diào)至≥12，用三氯甲烷進一步萃取3次，合并萃取液，旋蒸回收三氯甲烷，另加三氯甲烷定容至100 mL，得待測溶液。用顯色劑碘化鉍鉀檢測生物堿含量。

1.3.3樣品最大吸收波長的確定取1 mL“1.3.2”節(jié)中制備好的樣品溶液，用三氯甲烷稀釋并定容至25 mL，在210～450 nm范圍內(nèi)掃描溶液的紫外吸收光譜，間隔10 nm掃描，得最大波長范圍為240～300 nm，然后在此范圍內(nèi)間隔2 nm繼續(xù)掃描，測得該溶液在268 nm處有最大吸收峰，因此選擇268 nm作為檢測波長。

1.3.4唐古特烏頭標準溶液的制備和線性關(guān)系考察

1.3.4.1標準溶液的制備準確稱取唐古特烏頭生物堿對照品1.545 mg，加適量三氯甲烷，微熱溶解，移入25 mL容量瓶中，冷至室溫后稀釋至刻度處，搖勻，即得濃度為0.061 8 mg/mL 的標準溶液。

1.3.4.2標準曲線的繪制準確量取“1.3.4.1”節(jié)的標準溶液0、1、2、3、4、5、6 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加三氯甲烷稀釋至刻度處，搖勻，靜置。以三氯甲烷為空白對照，于268 nm波長處測其吸光度（表1）。以生物堿對照品濃度C（μg/mL）為橫坐標、吸光度（D268 nm）為縱坐標繪制標準曲線（圖1），進行線性回歸，得回歸方程：D268 nm=0.060 6C-0001 1，r2=0.999 6。結(jié)果表明，生物堿對照品在2.00～15.00 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.3.5生物堿的提取及含量測定

1.3.5.1生物堿的提取及含量測定方法準確稱取1.000 g唐古特烏頭藥材粉末，用“1.3.2”節(jié)的方法進行提取、處理，定容至50 mL容量瓶中，待測。準確量取1.25 mL待測液，用三氯甲烷定容至25 mL容量瓶中，在268 nm處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算出唐古特烏頭提取液中的生物堿含量。

1.3.5.2生物堿提取條件的優(yōu)化根據(jù)單因素試驗結(jié)果和對各種因素的考察，以提取物中的總生物堿含量為考察指標，以藥材浸泡時間、料液比（質(zhì)量比）、提取時間、提取溫度為考察因素，采用L9（34）設(shè)計進行正交試驗，考察其最佳提取條件。試驗的因素水平設(shè)置見表2。

2結(jié)果與分析

2.1唐古特烏頭總生物堿最佳提取工藝的確定

2.1.1直觀分析由表3可知，各因素對唐古特烏頭中總生物堿提取率的影響大小順序為A>C>B>D，即料液比>提取溫度>提取時間>浸泡時間;料液比對提取唐古特烏頭中生物堿提取率的影響較大，浸泡時間的影響較小，最佳提取工藝為A3B2C2D1，即當料液比為1 g ∶15 mL、浸泡時間為2 h、提取溫度為40 ℃、提取時間為15 min時，提取效果最佳。

2.1.2方差分析由表4可知，A因素對提取指標的影響顯著（P<0.05），與直觀分析結(jié)果一致。

2.2最佳提取工藝條件的驗證

為了考察和驗證最佳提取工藝條件的穩(wěn)定性和試驗結(jié)果，在料液比為1 g ∶15 mL、浸泡時間為2 h、提取溫度為40 ℃、提取時間為15 min的條件下，進行3組平行試驗。由表5可以看出，3次試驗結(jié)果指標均高于正交試驗中的任何1組，藏藥唐古特烏頭中總生物堿含量為1.014%，相對標準偏差為0.74%，說明篩選的最佳工藝條件穩(wěn)定可靠。

3結(jié)論

微波輔助萃?。╩icrowave assisted extraction，簡稱MAE）是利用介質(zhì)在微波作用下高速運動產(chǎn)生的熱效應[11]，使細胞壁破裂，從而使得胞外溶劑易于進入細胞內(nèi)，溶解并釋放胞內(nèi)產(chǎn)物，具有強力、瞬時、高效、耗時短等特點[12]。本試驗采用微波輻射法提取唐古特烏頭中的生物堿，大大縮短了提取時間和溶劑用量，以紫外分光光度法測定其含量，并通過正交試驗設(shè)計確定了藏藥唐古特烏頭中生物堿的最佳提取工藝條件。試驗結(jié)果表明，料液比為1 g ∶15 mL、浸泡時間為2 h、提取時間為15 min、提取溫度為40 ℃時，總生物堿提取率可達1.014%，具有較高的提取效率。本研究方法用時短、效率高、穩(wěn)定性好，為唐古特烏頭中總生物堿的進一步應用和開發(fā)提供了一定的參考和科學依據(jù)。

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