陳亨德 褚武英 李玉瓏 許友卿 丁兆坤 鐘藝文 王利香 安曉玲

摘要：為了解克隆羅非魚SIRT1基因，并分析其在不同組織器官中的表達(dá)量和饑餓前后白肌和肝中的表達(dá)量，以期為研究羅非魚基因功能和代謝調(diào)控機(jī)制提供參考。采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)由羅非魚肌肉組織克隆獲得羅非魚SIRT1基因，并用生物信息學(xué)方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QRT-PCR）技術(shù)對(duì)SIRT1在羅非魚體內(nèi)表達(dá)進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，SIRT1基因開放閱讀框（ORF）為2 109 bp，共編碼702個(gè)氨基酸，具有保守的DUF、SIR2和TPP保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，羅非魚與伯氏樸麗魚和紅麗魚的SIRT1首先成簇，說明2個(gè)物種的親緣關(guān)系最接近。且SIRT1基因在所檢測(cè)的組織、器官中均有表達(dá)，其中白肌、腸道中表達(dá)量最高，且差異顯著（P<0.05）。與饑餓組0 d相比，饑餓組7 d的白肌SIRT1基因mRNA的表達(dá)無明顯變化，而肝表達(dá)量卻顯著增加（P<0.05）。提示羅非魚SIRT1基因可作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)體糖代謝、脂肪代謝的候選基因之一。

關(guān)鍵詞：羅非魚;SIRT1基因;實(shí)時(shí)定量PCR;饑餓;系統(tǒng)進(jìn)化樹

中圖分類號(hào)： S917.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）21-0103-04

收稿日期：2018-07-25

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：31472256）;湖南省長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：ZD1601003）;湖南省長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃一般項(xiàng)目（編號(hào)：K1705044）。

作者簡(jiǎn)介：陳亨德（1993—），男，福建泉州人，碩士，研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物營(yíng)養(yǎng)、生理生化和分子生物學(xué)。E-mail：335776526@qq.com。

通信作者：丁兆坤，博士，教授，研究方向?yàn)榄h(huán)境生物學(xué)、水生動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、生理、生化和分子生物學(xué)。E-mail：zhaokun.ding@hotmail.com。

羅非魚是聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）向全世界推廣的優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖魚類品系，目前全球有近百個(gè)國(guó)家和地區(qū)進(jìn)行羅非魚的規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖，羅非魚同時(shí)也是我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部主要推廣的重要淡水養(yǎng)殖品種，我國(guó)羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量在世界上高居榜首。尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）是羅非魚類中的主要養(yǎng)殖品種，該魚的養(yǎng)殖性能極其優(yōu)越，具有生長(zhǎng)快、食性廣、抗病強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美、富含谷氨酸和甘氨酸等特點(diǎn)[1]，深受許多美食愛好者的喜愛。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1（silent mating type information regulation 2 homolog1，簡(jiǎn)稱SIRT1）是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核甘酸（NAD+）的組蛋白去乙?；竅2]，于1999年從人類中發(fā)現(xiàn)[3]。SIRT1能夠廣泛表達(dá)于成熟組織，在胚胎早期和生殖細(xì)胞中含量也較高[4]。哺乳動(dòng)物中Sirtuins家族共有7名成員（SIRT1～SIRT7）[3]，其中SIRT1與沉默信息調(diào)節(jié)因子2的同源性最高[5]，是Sirtuins家族中目前研究得最為廣泛的1名成員。SIRT1在機(jī)體內(nèi)可通過對(duì)幾種控制代謝轉(zhuǎn)錄因子的去乙?；饔脕碚{(diào)節(jié)其活性，廣泛參與機(jī)體的糖代謝和脂肪代謝通路，還參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)過程[6]。SIRT1還可抑制成脂肪分化因子PPARγ的轉(zhuǎn)錄因子活性，減少脂肪的合成與堆積[7]。同時(shí)能夠使FOXO1、STAT3等去乙?；龠M(jìn)糖異生而抑制糖酵解[8-9]。SIRT1還可以通過環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，簡(jiǎn)稱CREB），調(diào)節(jié)糖脂代謝[10]。目前對(duì)SIRT1基因的研究主要還是集中在人類、小鼠、家畜與家禽（豬、羊、雞等）上，對(duì)魚類SIRT1基因的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。本研究探討羅非魚SIRT1 mRNA在不同組織器官中的規(guī)律性表達(dá)，目的是為今后羅非魚SIRT1基因的相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用魚是新鮮健康的成年羅非魚，體質(zhì)量約為（500±10） g，于2018年3月采自湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所。分別解剖正常組0 d和饑餓組7 d試驗(yàn)魚，采集白肌、紅肌、肝、腦、脾、腎、腸道和心臟8個(gè)新鮮的組織器官，放入已滅菌的1.5 mL 離心管中，立即轉(zhuǎn)存于液氮罐中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，移置于-80 ℃冰柜中保存，用于總RNA提取和基因克隆。所用各種試劑、消耗品和容器均用高壓滅菌鍋處理，解剖工具和研磨器具經(jīng)160 ℃烘烤6 h，滅活RNA酶。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1羅非魚SIRT1基因的克隆

用Trizol Reagent試劑盒，并根據(jù)Trizol Reagent試劑盒使用說明書從成年羅非魚各組織器官中分別提取總RNA。將提取的羅非魚不同組織器官的總RNA稀釋后測(cè)定其D260 nm/D280 nm和濃度（ng/μL），并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的RNA進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)其純度和完整性。采用寶生物工程（大連）有限公司提供的cDNA合成試劑盒，并按試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。

1.2.2內(nèi)參基因的選擇及引物設(shè)計(jì)

從GenBank中下載其他魚類的SIRT1基因全序列，用DNAStar比對(duì)進(jìn)行保守性分析。并運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)羅非魚內(nèi)參基因和目的基因的引物序列（表1），送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成，合成后再1次對(duì)所有引物進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3羅非魚SIRT1基因片段的克隆與序列測(cè)定

以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR克隆，將擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析其純度。然后采用Omega純化試劑盒割膠回收，用TaKaRa公司的pMD19-T載體試劑盒，并按說明書連接過夜，再將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，取50 μL 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板，37 ℃正置1 h后倒置過夜培養(yǎng)，挑取白色單菌斑培養(yǎng)，菌液經(jīng)過PCR擴(kuò)增，電泳分析確定插入片段是否正確。對(duì)于篩選出的陽性菌，克隆提取質(zhì)粒送上海博尚生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)模板比對(duì)以及National Center for Biotechnology Information（NCBI）數(shù)據(jù)庫中Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）檢索，確定為目的基因片段后，使用DNAstar軟件進(jìn)行序列拼接。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR

本試驗(yàn)采用SYBR GreenⅠ染料法，在QRT-PCR儀（博樂公司CFX96TM型號(hào)）上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。以最小的CT值和最高的熒光值為標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)引物的濃度、循環(huán)的條件、退火溫度等試驗(yàn)流程進(jìn)行優(yōu)化。擴(kuò)增二步法反應(yīng)程序如下：95 ℃ 30 s預(yù)變性;95 ℃ 5 s變性，58 ℃ 25 s退火、延伸，循環(huán)40次;繪制熔解曲線;65～95 ℃，每0.5 ℃讀板1次。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR后，根據(jù)收集到的目的基因與內(nèi)參基因的CT值，運(yùn)用2-ΔΔCT方法[11]計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量。運(yùn)用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型（GLM）對(duì)SIRT1基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析，采用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行多重比較，并用SigmaPlot 12.0軟件對(duì)處理完成的數(shù)據(jù)作羅非魚SIRT1基因的相對(duì)表達(dá)柱狀圖。所有結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。P<0.05為有顯著差異。

2結(jié)果與分析

2.1羅非魚SIRT1基因的生物信息學(xué)分析

SIRT1基因編碼區(qū)為2 109 bp（GenBank登錄號(hào)：MH229477），編碼702個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的SIRT1蛋白相對(duì)分子量為76 571.30 u，等電點(diǎn)為4.64。用“http：//www.molbiol-tools.ca/Motifs.htm”網(wǎng)站上的在線軟件進(jìn)行氨基酸結(jié)構(gòu)域分析，可知SIRT1基因具有保守的DUF、SIR2和TPP結(jié)構(gòu)域（圖1）。

2.2氨基酸序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從NCBI網(wǎng)站上收集到不同物種SIRT1基因的氨基酸序列（表2），然后利用Bio Edit和MEGA 7.0軟件分別進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)及SIRT1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建（圖2）。

圖2的進(jìn)化樹分析表明，羅非魚SIRT1與伯氏樸麗魚和紅麗魚的SIRT1首先成簇，三者同源性高達(dá)98%，說明2個(gè)物種的親緣關(guān)系最為接近。魚類SIRT1與哺乳類、鳥類、昆蟲類及人的同源性存在一定的差異，其原因可能是所含的蛋白質(zhì)種類和構(gòu)型差異較大所致。由分析樹可以看出，即使同為魚類的孔雀魚和白斑狗魚，即低等魚類和高等魚類之間氨基酸肽鏈長(zhǎng)度和空間構(gòu)型仍有巨大的差別。

2.3不同組織中SIRT1 mRNA表達(dá)量分析

采用QRT-PCR檢測(cè)羅非魚的白肌、紅肌、肝、脾、腎、腸道、腦和心臟組織/器官中SIRT1基因mRNA的表達(dá)量，表達(dá)結(jié)果（圖3）顯示，SIRT1基因在白肌和腸道組織中的表達(dá)量最高，在腦組織中也有較高表達(dá)，但在肝、脾、腎等組織中的表達(dá)量相對(duì)較弱，表明SIRT1在羅非魚的不同組織器官中表達(dá)差異較大，具有較強(qiáng)的組織器官特異性。

2.4饑餓7 d羅非魚白肌和肝SIRT1基因mRNA表達(dá)量

在饑餓狀況下，肌肉和肝在機(jī)體能量調(diào)節(jié)中發(fā)揮十分重要的作用。經(jīng)過7 d饑餓的羅非魚（饑餓組），與饑餓0 d的羅非魚相比較，饑餓組羅非魚的白肌和肝SIRT1 mRNA表達(dá)量均有增加，且在肝中的表達(dá)量顯著上升（P<0.05）（圖4），說明在饑餓環(huán)境中，羅非魚SIRT1基因與機(jī)體的脂肪代謝及能量代謝有密切關(guān)系。

3討論

本研究采用RT-PCR技術(shù)克隆得到羅非魚SIRT1基因的完整開放閱讀框（ORF）區(qū)序列為2 109 bp，具有保守的DUF、SIR2和TPP結(jié)構(gòu)域，其蛋白相對(duì)分子量為76 571.30 u，等電點(diǎn)為4.64，共編碼702個(gè)氨基酸。本研究利用Bio Edit和MEGA 7.0軟件分別進(jìn)行氨基酸序列的比對(duì)及構(gòu)建SIRT1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹模型，用作建樹的18個(gè)物種分屬于硬骨魚綱、昆蟲綱、鳥綱以及哺乳綱4大類群。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，羅非魚SIRT1與伯氏樸麗魚和紅麗魚的SIRT1首先成簇，表示2個(gè)物種間的親緣關(guān)系較近。魚類SIRT1與哺乳類、鳥類、昆蟲類以及人的同源存在一定的差異，其原因可能是所含的蛋白質(zhì)種類和構(gòu)型差異較大。即使同為魚類，如孔雀魚和白斑狗魚，低等魚類和高等魚類之間的氨基酸肽鏈長(zhǎng)度和空間構(gòu)型仍有一定的差距，推測(cè)SIRT1基因的氨基酸肽鏈長(zhǎng)度和空間結(jié)構(gòu)可能與肌肉發(fā)育和進(jìn)化的程度有關(guān)。

羅非魚SIRT1基因mRNA表達(dá)量在所檢測(cè)的各組織器官中均有表達(dá)，在白肌和腸道組織中表達(dá)量最高，在腦組織也有較高的表達(dá)，說明羅非魚SIRT1基因的表達(dá)具有較強(qiáng)的組織特異性。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1定位于小鼠下丘腦的禁食區(qū)，能通過抑制脂肪細(xì)胞基因和FOXO1的表達(dá)，影響脂質(zhì)代謝[12-15]。Bai等在對(duì)豬的研究中也發(fā)現(xiàn)，SIRT1基因的表達(dá)量與脂肪代謝存在密切的相關(guān)性[16-17]。潘洋洋等在SIRT1基因?qū)d羊不同組織器官影響的差異性研究中發(fā)現(xiàn)，綿羊SIRT1基因在肌肉組織中具有較高表達(dá)[18]。羅非魚SIRT1基因在白肌組織和腸道組織中的表達(dá)量最高的原因可能是SIRT1基因廣泛參與羅非魚的能量代謝的調(diào)節(jié)作用，但目前還沒有相關(guān)研究能夠證實(shí)這一點(diǎn)，需要進(jìn)一步分析研究。

肝臟作為主要糖脂代謝器官，能夠影響機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分解吸收和激素信號(hào)的傳遞，在機(jī)體中發(fā)揮著巨大作用。研究發(fā)現(xiàn)，在短期禁食條件下，SIRT1可以抑制糖異生關(guān)鍵因子TORC2，影響血糖濃度。而在長(zhǎng)期禁食條件下，SIRT1去乙?；⒓せ頟GC1-α和PPARα，促進(jìn)脂肪酸的氧化并改善葡萄糖的穩(wěn)態(tài)[19]。在對(duì)人體肝細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，生理?xiàng)l件下PGC-1α上賴氨酸殘基會(huì)在SIRT1的作用下發(fā)生去乙酰化，將PGC-1α激活，從而有效抑制糖酵解，促進(jìn)了肝葡萄糖的輸出[20-21]。PPARγ通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸合成可加快脂肪沉積，而PPAR-γ在SIRT1基因過表達(dá)的情況下發(fā)生轉(zhuǎn)錄抑制，抑制脂肪生成，促進(jìn)游離脂肪酸釋放及脂解作用的增加[7]。此外，SIRT1還能對(duì)膽固醇等進(jìn)行乙?；⒒罨?，從而對(duì)肝中的膽固醇通量進(jìn)行有效調(diào)節(jié)[22]，進(jìn)一步證實(shí)了SIRT1基因表達(dá)與脂肪代謝存在相關(guān)性。本研究饑餓條件下也發(fā)現(xiàn)，羅非魚SIRT1基因在肝中表達(dá)量顯著增加（P<0.05），可見SIRT1基因與機(jī)體的糖代謝和脂肪代謝聯(lián)系十分密切。因此推測(cè)SIRT1基因可作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控機(jī)體糖代謝、脂肪代謝的候選基因之一，能夠通過多種通路途徑直接或間接調(diào)節(jié)羅非魚的脂質(zhì)代謝。

4結(jié)論

羅非魚的白肌、紅肌、肝、腦、脾、腎、腸道和心臟組織器官中SIRT1基因mRNA表達(dá)量的結(jié)果顯示出一定的規(guī)律性，且在白肌和腸道組織中表達(dá)量最高，推測(cè)SIRT1基因可能通過不同的信號(hào)通路，參與羅非魚能量代謝的調(diào)節(jié)。而且在饑餓處理下SIRT1基因mRNA的表達(dá)量在白肌中有所增加，在肝中顯著增加（P<0.05），表明羅非魚SIRT1基因可能與脂肪代謝活動(dòng)密切相關(guān)，能夠通過多種通路途徑直接或間接調(diào)節(jié)羅非魚的能量代謝。

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