黃忠興 何宏星 王亞新 邢作超 周常文 林炤華

(1. 福建醫(yī)科大學實驗動物中心，福州 350122)(2. 福建醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院細胞生物學與遺傳學系，福州 350122)

動物行為學研究是一種常用于評價實驗動物或模式生物的實驗方法，它通過觀察實驗對象在不同變量下如：食物誘導、環(huán)境變化、電刺激等條件下的直觀應答，記錄實驗對象在心理情緒、生理功能等方面產(chǎn)生的變化，并以此了解變量可能對實驗動物產(chǎn)生的影響[1-2]。行為學研究常用的實驗方法有morris水迷宮[3]、Y迷宮[4-5]、高架十字迷宮[1，6]、曠場實驗[6-7]、黑箱實驗等。

去整合素和金屬蛋白酶10(A disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)是一種廣泛存在于細胞膜表面的蛋白酶。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ADAM10不僅可以通過非淀粉樣蛋白水解途徑裂解淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)從而抑制了β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide，Aβ)的形成[8-9]，也可以通過N-鈣黏蛋白、Notch等信號途徑調(diào)控神經(jīng)元樹突的形成與成熟[10]，因此ADAM10與神經(jīng)退行性疾病特別是阿爾茲海默病密切相關(guān)。

本研究利用我們實驗室建立的CaMKIIα-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與ADAM10Floxp/Floxp轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，繁殖并制備出能夠存活至成年的大腦神經(jīng)細胞特異性ADAM10 cKO(conditional knock-out，條件性基因敲除)小鼠[11]。為了進一步確定本實驗室建立的條件性ADAM10基因缺失小鼠模型是否可以作為Alzheimer病的動物模型[12]，我們通過Y迷宮的自發(fā)交替與新異探索實驗、高架十字迷宮實驗以及曠場實驗對12月齡的ADAM10 cKO小鼠和對照組C57BL/6 J小鼠進行評估，以了解ADAM10基因的缺失是否會對成年小鼠的自主活動能力及探究學習能力產(chǎn)生影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

C57BL/6 J成年雄性小鼠10只，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供(許可證號：SCXK(滬)2012-0002)，作為對照組，大腦神經(jīng)細胞特異性ADAM10 cKO成年雄性小鼠10只，作為實驗組,均為12月齡。動物于實驗前一周置于實驗室適應環(huán)境，室溫(23±2)℃，濕度50%左右，自由進食與飲水。

1.2 實驗儀器

Y迷宮儀器，共三個臂，各個臂夾角120度，每一臂尺寸為30 cm×8 cm×15 cm(長×寬×高)。高架十字迷宮儀器：由兩條開臂70 cm×8cm和兩條閉臂70 cm×8cm×5 cm，經(jīng)中央?yún)^(qū)8 cm×8 cm連接而成，封閉臂和開放臂的底部離地面50 cm，底面和壁部均漆成白色。曠場儀器：黑色敞口鐵皮箱40 cm×40 cm×40 cm，箱底劃為16個方格，沿箱壁格稱外周格，其余為中央格。實驗儀器上方 1.5 m處安置攝像鏡頭，全過程錄像，及SMART 2.0軟件系統(tǒng)進行分析(PanLab, Barcelona, Spain)，為深圳瑞沃德公司引進西班牙產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1Y迷宮自發(fā)性交替實驗: 小鼠由其中一臂的末端放入，自由探索 8 min，實驗人員脫離小鼠視線。行動軌跡通過攝像跟蹤，依次記錄小鼠所進入每個臂的順序號。由此統(tǒng)計進入通道的總次數(shù)(total arm entries)和自發(fā)交替率。自發(fā)交替率(%)=含全部三個臂序號的三聯(lián)串總變換次數(shù)/進入迷宮臂的可能變換次數(shù)(進入臂的總次數(shù)-2)×100%[5]。通過Y迷宮自發(fā)交替性實驗可以評價實驗動物的自發(fā)活動能力[13]。

1.3.2Y迷宮新異探索實驗: 該實驗分為兩部分，即實驗的第一個階段為訓練期，第二個階段為檢測期。新異臂：在實驗的第一個階段即訓練期時用隔板遮擋住，在第二個階段即檢測期時打開；起始臂：小鼠進入迷宮時所在的臂。整個實驗過程中起始臂和其他臂都是一直打開的，動物可以自由出入。迷宮上方1.5 m處安置攝像鏡頭，全過程拍攝錄像。

1.3.2.1 訓練期：新異臂被隔板擋住，小鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂中自由活動10 min，訓練結(jié)束后，小鼠被放回飼養(yǎng)籠。2 h后進行第二個階段即檢測期的實驗。

1.3.2.2 檢測期：抽去新異臂的擋板，小鼠由起始臂放入，在3個臂中自由探索活動5 min。錄像記錄5 min內(nèi)每只小鼠在各個臂停留的時間和穿梭次數(shù)[13]。

1.3.3高架十字迷宮實驗: 室內(nèi)安靜暗光。小鼠從中央?yún)^(qū)面向閉臂放入迷宮，記錄6 min內(nèi)的活動情況，自動攝像系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)記錄觀察指標：小鼠進入兩臂總次數(shù)、進入開臂次數(shù)、開臂滯留時間，開臂滯留時間%等。可以通過比較小鼠在開臂和閉臂內(nèi)的滯留時間和路程來評價實驗動物的自發(fā)探索行為與焦慮行為[6]。

1.3.4曠場實驗: 將小鼠放入正中一格。6 s后開始記錄6 min內(nèi)各項行為指標。自動攝像系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)記錄觀察指標，其中包括：每只小鼠的爬行總距離、中央格進入次數(shù)、滯留時間、運行距離%、外周滯留時間、進入邊角次數(shù)。曠場實驗以實驗動物在新奇環(huán)境之中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時間等作為測試指標，通過統(tǒng)計學分析，評價兩組小鼠間的自主活動能力和探究行為的差異[7]。

每只小鼠實驗結(jié)束后用75% 乙醇擦拭、清洗實驗儀器，并用紙巾擦拭干凈，以最大程度地減少動物通過嗅覺進行的線索識別。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 Y迷宮自發(fā)交替實驗

cKO小鼠的自發(fā)交替率(0.50±0.28)%顯著小于對照組小鼠(0.74±0.14)%(P<0.05，圖1A)?？傔M臂次數(shù)cKO小鼠(10.10±6.74)顯著小于對照組小鼠(20.30±8.93)(P<0.05,圖1B)。在迷宮中的總活動路程cKO小鼠(5352.85±2213.65)cm顯著小于對照組小鼠(8724.81±2396.91)cm(P<0.01,圖1C)。

圖1 小鼠Y迷宮自發(fā)交替實驗注：A: 自發(fā)交替率；B：進臂總次數(shù)；C：活動總路程；數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準誤，n=10；*P<0.05，**P<0.01Fig.1 Spontaneous alternation experiment of Y mazeNote：A: Spontaneous alternation rate;B: total numbers of arm entries; C: total distance moved. Data expressed as means±SEM,n=10; *P<0.05，**P<0.01

2.2 Y迷宮新異探索實驗

在新異臂中探索的次數(shù)對照組小鼠(5.10±2.23)s顯著大于cKO小鼠(2.10±0.74)(P<0.01,圖2 A)。兩種小鼠探索新異臂所花的時間對照組小鼠(131.32±47.24)s顯著大于cKO小鼠(73.61±51.25)s(P<0.05,圖2B)。對照組小鼠在新異臂中活動的路程(2771.50±868.51)cm顯著大于cKO小鼠(920.07±305.98)cm(P<0.001,圖2C)。

圖2 小鼠Y迷宮新異探索實驗注：A：新異臂探索次數(shù)；B：新異臂探索時間；C：新異臂探索路程；數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準誤，n=10；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001Fig.2 New exploration experiment of Y mazeNote：A:munbers of times entering new arm; B: new arm time; C: distance in the new arm.Data expressed as means±SEM,n=10; *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3 高架十字迷宮實驗

從實驗結(jié)果來看，開臂進入次數(shù)對照組小鼠(8.5±1.7)顯著小于cKO小鼠(13.1±1.2)(P<0.05，圖3A)。開臂滯留時間對照組小鼠(46.5±9.3)顯著小于cKO小鼠(86.4±15.3)s(P<0.05，圖3B)。開臂滯留時間占總時間百分比對照組小鼠(12.9±2.5)顯著小于cKO小鼠(24.2±4.2)%(P<0.05，圖3C)。

圖3 小鼠高架十字迷宮實驗注：A: 進入開臂次數(shù)；B：開臂滯留時間；C：開臂滯留時間占總時間百分比；數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準誤，n=10；*P<0.05Fig.3 mouse in elevated plus mazeNote：A: open arm entries; B: open arm time; C:percent of open arm/total time.Data expressed as means±SEM,n=10; *P<0.05

2.4 曠場實驗

從總體情況來看，對照組小鼠在6 min內(nèi)的活動總路程為(7479±580.4)cm，cKO小鼠總路程為(6408±890.3)cm，二者無顯著性差異(P>0.05，圖4A)。對照組小鼠進入中央?yún)^(qū)的次數(shù)(56.2±11.7)顯著大于cKO小鼠(18.2±5.4)(P<0.001,圖4B)；兩種基因型小鼠進入周邊區(qū)的次數(shù)分別為對照組小鼠(35.7±4.4)、cKO小鼠(35.4±5.7)兩者無顯著差異(P﹥0.05,圖4B)。從中央?yún)^(qū)活動路程占總路程的百分比來看，對照組小鼠(24.0±4.9)與cKO小鼠(7.8±1.7)之間無顯著差異(P=0.06,圖4C)。對照組小鼠在中央?yún)^(qū)的滯留時間(66.9±20.4)s顯著大于cKO小鼠(13.9±5.0)s(P<0.05)；周邊區(qū)滯留時間對照組小鼠(292.2±20.2)s顯著小于cKO小鼠(345.4±4.9)(P<0.05，圖4D)。

圖4 小鼠曠場實驗注：A：活動總路程；B：進入中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)的次數(shù)；C：中央?yún)^(qū)活動路程占總路程百分比；D：中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)滯留時間；數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準誤，n=10，*P<0.05，***P<0.001Fig.4 Mouse in open field testNote：A:total distance moved;B: number of times entering the central area and out ring; C: percent of central area/total distance;D: time of central area and out ring. Data expressed as means±SEM,n=10， *P<0.05，***P<0.001

3 討論

在評估神經(jīng)退行性疾病的動物模型中，Y迷宮的研究應用十分廣泛，它是研究動物自發(fā)活動能力和對空間辨別的學習記憶能力的常用實驗方法[4-5]。為了進一步確定本實驗室建立的條件性ADAM10基因缺失小鼠模型是否可以作為Alzheimer病的動物模型，ADAM10的缺失又是否會對成年小鼠的活動能力及其空間辨別的學習記憶能力有影響。我們通過Y迷宮的方法對12月齡的ADAM10 cKO小鼠和對照C57BL/6 J成年小鼠進行實驗。結(jié)果表明，ADAM10 cKO小鼠與野生型C57BL/6 J小鼠相比較，其自發(fā)交替活動減少，活動能力下降，對新異空間的探索能力也有所下降。為了避免由于長時間實驗導致小鼠活動能力降低繼發(fā)性引起實驗數(shù)據(jù)的偏差。實驗中，隨機安排不同的小鼠對應Y迷宮的起始臂、新異臂和其他臂，但是對于同一只小鼠而言，在迷宮實驗的兩個階段，三個臂是固定的。由于小鼠對該迷宮測試的記憶時間最長不超過數(shù)小時，所以該迷宮測試可以在同一只小鼠上反復進行，但是兩次實驗間隔需至少一周時間，并需改變?nèi)齻€臂的搭配。評價空間識別記憶能力可以用小鼠在新異臂中停留的時間和穿梭的路程作為檢測指標，記憶損害者在新臂中探索的時間和路程會縮短。這說明ADAM10基因缺失降低了成年小鼠的活動能力和其對空間辨別的學習記憶能力。ADAM10的缺失對小鼠造成了小鼠行為學方面的改變。

高架十字迷宮利用小鼠面對新事物(開臂)時會產(chǎn)生好奇心去探究,同時它們又有嗜暗的天性(閉臂),當兩者之間發(fā)生探究與回避的沖突時,容易引發(fā)焦慮心理，因此可以通過比較小鼠在迷宮開臂和閉臂中的行為表現(xiàn)來評估焦慮程度。在高架十字迷宮中，較對照小鼠，ADAM10 cKO 活動軌跡更復雜，并且統(tǒng)計結(jié)果指標明顯增加，即活動總次數(shù)、進入開臂次數(shù)、開臂滯留時間s、開臂滯留時間%均有顯著增加。ADAM10 cKO小鼠在復雜環(huán)境中主動活動能力提高，焦慮感降低。這可能是由于ADAM10基因缺失后引起的神經(jīng)元樹突突觸前膜的損傷，導致神經(jīng)信號傳遞的異常，進一步引發(fā)小鼠焦慮感減弱，從而表現(xiàn)為在復雜環(huán)境下的低焦慮狀態(tài)和主動活動能力的提高。

在曠場實驗中，較對照小鼠，ADAM10 cKO 小鼠活動軌跡顯然更簡單，統(tǒng)計數(shù)據(jù)指標降低，即爬行總距離縮短，中央爬行距離%降低，進入邊角次數(shù)和中央滯留時間顯著減少；而外周滯留時間明顯延長。張玲和林燕利用已構(gòu)建的APP轉(zhuǎn)基因鼠和APP/ADAM10雙轉(zhuǎn)基因鼠來研究小鼠的行為學變化，發(fā)現(xiàn)，高架十字迷宮實驗中，與對照組小鼠相比，APP/ADAM10雙轉(zhuǎn)基因鼠活躍程度增加；曠場實驗中，與對照組小鼠相比，APP/ADAM10雙轉(zhuǎn)基因鼠活躍程度均降低[14]。Prox等研究發(fā)現(xiàn)：在高架十字迷宮實驗中，較對照小鼠，ADAM10 cKO組小鼠行動更加活躍；在曠場實驗中，較對照小鼠，ADAM10 cKO小鼠的社交活動探索能力減弱[15]。本文實驗結(jié)果與文獻報道中一致。與對照相比，ADAM10cKO小鼠焦慮情緒減弱，自主活動能力和探究行為能力較差。

綜上所述，本研究利用Y迷宮自發(fā)交替實驗、Y迷宮新異臂探索實驗、高架十字迷宮實驗和曠場實驗評估了ADAM10 cKO小鼠的自主活動能力和探究學習能力，其結(jié)果表明小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元ADAM10基因的缺失對小鼠的記憶和學習能力產(chǎn)生了明顯影響。