王淑菁 林 歡 付 瑞 李曉波 王 吉 岳秉飛 賀爭鳴

(1.中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050) (2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150001)

細(xì)小病毒感染是嚙齒類實驗動物常見的病原體感染之一。小鼠微小病毒(MVM)和小鼠細(xì)小病毒(MPV)兩種細(xì)小病毒均曾在小鼠中被分離得到。MVM易污染鼠源性細(xì)胞，比如 CHO細(xì)胞系中就曾分離到過MVM。MPV是鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物潛在的污染物。細(xì)小病毒感染小鼠，通常無癥狀臨床表現(xiàn)，但研究表明，在涉及免疫系統(tǒng)、腫瘤和移植的實驗中，體內(nèi)、外感染MVM和MPV將會嚴(yán)重影響實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可信性[1-3]。

FELESA、Charles River、日本實中研等實驗室關(guān)于實驗小鼠健康監(jiān)測的指南中，規(guī)定了需要對MVM和MPV兩種細(xì)小病毒均進(jìn)行檢測。我國的國標(biāo)中僅規(guī)定對實驗小鼠進(jìn)行MVM檢測，國內(nèi)尚未開展實驗小鼠感染MPV的研究。本研究擬將建立同時檢測MVM和MPV的熒光定量PCR方法，初篩樣本中是否存在細(xì)小病毒感染，再使用本實驗室已建立的MVM、 MPV特異性熒光定量PCR方法鑒定是哪種細(xì)小病毒感染[4]。不僅可以實現(xiàn)對免疫缺陷小鼠、細(xì)胞系及生物原材料的細(xì)小病毒檢測，還可以進(jìn)行大樣本的病毒篩查和鑒定。

1 材料與方法

1.1 病毒

小鼠微小病毒(MVM)、豬細(xì)小病毒、大鼠細(xì)小病毒H-1株和KRV株均購自美國ATCC。

1.2 主要試劑

Takara MiniBEST Viral RNA/DNA 提取試劑盒購自TaKaRa公司；TaqMan Universal PCR Master Mix購自Applied Biosystems公司。

1.3 引物和探針的設(shè)計

根據(jù)NCBI上發(fā)表的MVM(NC_001510)和MPV(NC_001630.1)基因組序列，通過BLAST比對分析分別選擇保守特異區(qū)域設(shè)計引物和探針，選擇MVM和MPV共有序列設(shè)計引物和探針。見表1。

表1 MVM-MPV熒光定量PCR的引物和探針Table 1 Primer and probe sequence for MVM-MPV real time PCR assays

1.4 MVM-MPV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

本實驗室無MPV毒種，僅有MVM毒種，需要建立MVM-MPV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。人工合成MVM(NC_001510)基因組2011-2240 DNA序列，該序列為MVM和MPV共有序列，轉(zhuǎn)入pMD19-T質(zhì)粒中，作為MVM-MPV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 熒光定量PCR方法反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系為：TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL，探針引物混合物(10 μmol/L)1 μL，無RNA酶水7 μL，模板2 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1min，40個循環(huán)。

1.6 考察特異性

提取MVM、大鼠細(xì)小病毒H-1株和KRV株、豬細(xì)小病毒的DNA，進(jìn)行熒光定量PCR，考察該引物和探針的特異性。

1.7 考察敏感性

倍比稀釋構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，從109至100拷貝/μL，每個稀釋度重復(fù)3次，考察該方法的靈敏度，以陽性檢出率為100%的最低稀釋倍數(shù)為該方法的靈敏度。

1.8 初步應(yīng)用

使用建立的熒光定量PCR方法檢測2014—2015年送檢的178份清潔級小鼠糞便。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及最佳線性范圍的確定

當(dāng)MVM-MPV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別在109～104拷貝/μL時， R2值可達(dá)0.99，R2值越接近1，代表標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系越好。見圖1。

圖1 MVM-MPV熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of MVM-MPV real-time PCR

2.2 考察特異性

檢測結(jié)果顯示，當(dāng)檢測MVM病毒和MVM-MPV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒時，均出現(xiàn)FAM熒光擴(kuò)增曲線。檢測大鼠細(xì)小病毒H-1株、大鼠細(xì)小病毒KRV株、豬細(xì)小病毒均無明顯擴(kuò)增曲線。表明所建立的熒光定量PCR法特異性強(qiáng)，與其他細(xì)小病毒均無交叉反應(yīng)。

2.3 考察敏感性

倍比稀釋構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，從109至100拷貝/μL，以陽性檢出率為100%的最低稀釋倍數(shù)為該方法的靈敏度，檢測結(jié)果顯示，該方法檢測MVM-MPV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的靈敏度為101拷貝/μL。見圖2。

圖2 MVM-MPV熒光定量PCR方法的靈敏度Fig.2 The sensitivity of MVM-MPV real-time PCR

2.4 初步應(yīng)用

2.4.1MVM-MPV熒光定量PCR初篩176份清潔級小鼠糞便：對2014—2015年送檢的178份清潔級小鼠糞便樣本，提取DNA后應(yīng)用MVM-MPV熒光定量PCR進(jìn)行初篩，檢測顯示出現(xiàn)兩份陽性樣本。

2.4.2應(yīng)用本實驗室建立的MVM熒光定量PCR和MPV熒光定量PCR分別檢測陽性樣本，以確定為哪種細(xì)小病毒感染，檢測結(jié)果顯示，2份陽性樣本均檢測為MVM陰性，MPV陽性。

2.4.3陽性樣本測序：將兩份陽性樣本DNA送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行全基因組測序，測序得到可信的堿基序列4 016 bp，在 NCBI上進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示與MPV(NC_001630.1)的序列一致率可達(dá)96%，確定兩份陽性樣本感染的病毒為MPV。見圖3。

圖3 序列比對結(jié)果注：Identities為兩段序列的一致性；比對序列1為測序得到的4 016 bp堿基序列；比對序列2為MPV基因組序列(Mouse parvovirus 1,序列號NC_001630.1)；比對結(jié)果為兩段序列中有3 843 bp序列完全一致，一致率為96%Fig.3 BLAST resultNote： Identities is the consistent rate of two sequences. The first sequence is the sequence of 4 016 bp base obtained by sequencing and the second sequence is the MPV genome sequence (Mouse parvovirus 1, complete genome, sequence number NC_001630.1). The blast result showed that the 3 843 bp sequences of the two sequences were identical,and the concordance rate was 96%.

3 討論

細(xì)小病毒并不引起小鼠明顯臨床疾病和組織學(xué)病變，但細(xì)小病毒可通過對小鼠體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的影響，從而對實驗研究的結(jié)果造成嚴(yán)重偏差。因此，開展MVM和MPV的檢測，對于實驗小鼠以及鼠源性生物材料或鼠源性細(xì)胞系具有重要意義[5]。

國外對實驗小鼠進(jìn)行細(xì)小病毒檢測時發(fā)現(xiàn)，MPV感染占77%，MVM感染占16%，而混合感染占7%[6-7]。Wang等檢測臺灣地區(qū)178份小鼠脾臟DNA樣品中，20份樣品為MPV陽性，178份樣品MVM檢測均為陰性。MPV的感染率(11.5%)高于歐美國家(1%～3%)，MVM的感染率與歐美國家(低于0.5%)相似[8]。國內(nèi)在細(xì)小病毒研究，尤其是實驗小鼠MPV研究方面報道較少[4,9-10]。

本研究中建立的小鼠MVM-MPV熒光定量PCR方法，最佳線性范圍為109～104拷貝/μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，靈敏度均為101拷貝/μL，特異性強(qiáng)，僅擴(kuò)增其對應(yīng)的細(xì)小病毒。應(yīng)用MVM-MPV探針對178份清潔級小鼠糞便DNA進(jìn)行初篩，檢測出2份陽性樣本，經(jīng)MVM、MPV特異性探針鑒定，確認(rèn)均為MPV感染。將陽性樣本進(jìn)行全基因組測序，與NCBI上MPV(NC_001630.1)序列比對，結(jié)果顯示其一致率可達(dá)96%，驗證了所建立方法的可靠性。目前本實驗室只有MVM毒種，沒有MPV毒種，本次篩查檢測出的MPV陽性樣本可進(jìn)一步分離MPV活病毒。目前國標(biāo)中并未規(guī)定實驗小鼠中必須進(jìn)行MPV檢測，研究中檢測到MPV陽性，需要引起實驗動物科技工作者的重視。本研究中建立的小鼠MVM-MPV熒光定量PCR方法，為同時檢測MVM、MPV，研究細(xì)小病毒感染情況提供了有效的技術(shù)支持。