童理明 ， 劉 松 ， 李江華 *， 堵國城 ， 陳 堅(jiān)

（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（Transglutaminase，EC 2.3.2.13，TGase），是一種能夠發(fā)生酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，最后形成ε-（γ-谷氨?；┵嚢彼峁矁r(jià)鍵的蛋白質(zhì)[1]?；谏鲜龃呋磻?yīng)的存在，TGase能夠促使各種蛋白質(zhì)分子間、分子內(nèi)交聯(lián)以及谷氨酰胺殘基的水解，從而提高蛋白質(zhì)的各種功能性質(zhì)，比如乳化性、溶解性等[2]；同時(shí)，TGase能夠通過將一些小分子物質(zhì)比如賴氨酸等引入蛋白質(zhì)，來增加蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值[3]。因此，市場上廣泛應(yīng)用TGase作為別具特色的食品添加劑于面制品、乳制品、碚烤制品、肉制品及水產(chǎn)品等食品的加工處理，市場需求量極其巨大[3-4]。

TGase特殊的催化能力使其在食品、紡織等工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛應(yīng)用，但其催化活性較低、熱穩(wěn)定性較差，使得TGase作為優(yōu)良的催化劑在工業(yè)中的應(yīng)用受到了嚴(yán)重限制[5-6]。因此，目前研究的熱點(diǎn)大部分都集中于如何提高TGase的熱穩(wěn)定性。作為最重要的蛋白質(zhì)熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)之一，蛋白質(zhì)折疊自由能（ΔG）是反應(yīng)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的一種通用性指標(biāo)[7]。在運(yùn)用定點(diǎn)突變方法改造酶分子的過程中，酶突變體的ΔG越小，其穩(wěn)定性反而越高[7]。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，部分軟件已經(jīng)可以通過對(duì)序列或結(jié)構(gòu)文件的分析來預(yù)測酶分子ΔG，如FoldX[8]、PoPMuSiC等[9]。我們可以基于折疊能的下降水平，再通過這些軟件，確定合適的突變位點(diǎn)。

在本研究中，首先應(yīng)用PoPMuSiC-2.1分析TGase突變體折疊自由能的變化值（即ΔΔG=ΔG（突變體）-ΔG（野生酶））[9]，之后確定了 ΔΔG變化較大的 P132位點(diǎn)為影響TGase酶熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵點(diǎn)，并構(gòu)建得到熱穩(wěn)定性提高的TGase突變體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 作者所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存的表達(dá)質(zhì)粒 pET-22b （+）/pro-TG： 用于表達(dá)S.hygroscopicuspro-TGase[10]； 大腸桿菌（Escherichia coli） JM109 和E.coliBL21（DE3）：來自 Qiagen 公司（美國）。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基（LB）：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L；pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（TB）：酵母粉 24 g/L，胰蛋白胨12 g/L， 甘油 5 g/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L；pH 7.4。

1.2 方法

1.2.1 突變體的構(gòu)建 將TGase成熟酶基因中的P132 位 點(diǎn) 分 別 突 變 成 P132I、P132G、P132M、P132Q。以S.hygroscopicuspro-TGase表達(dá)質(zhì)粒pET-22b（+）/pro-TG 為模板，進(jìn)行全質(zhì)粒 PCR，引物見表1。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.2 膠回收 詳細(xì)說明參見膠回收試劑盒的產(chǎn)品說明書（TAKARA公司）。

1.2.3 轉(zhuǎn)化 將連接好的pET-22b（+）/pro-TG轉(zhuǎn)進(jìn) JM109，測序正確后轉(zhuǎn)進(jìn)E.coliBL21（DE3）。

1.2.4 培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)條件：LB培養(yǎng)基，用250 mL搖瓶培養(yǎng)，裝液量10%，培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，培養(yǎng)時(shí)間10 h。

搖瓶發(fā)酵條件：TB培養(yǎng)基，采用250 mL搖瓶進(jìn)行培養(yǎng)，裝液量10%，接種體積分?jǐn)?shù)3%，培養(yǎng)溫度 37℃，轉(zhuǎn)速220 r/min，當(dāng) OD600達(dá)到 2.0時(shí)，終濃度為0.4 mmol/mL的IPTG誘導(dǎo)，20℃誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h。1.2.5 TGase蛋白純化 將重組菌株的發(fā)酵液經(jīng)過12 000 r/min離心后收集發(fā)酵上清液。將發(fā)酵上清液采用微孔濾膜（0.25 μm）過濾去除雜質(zhì)后，將樣品進(jìn)樣，注入AKTA蛋白純化儀的鎳柱。上樣緩沖液A 液：50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、0.3 mol/L NaCl、20 mmol/L咪唑；洗脫緩沖液B液：50 mmol/L 磷 酸 鹽 緩 沖 液 （pH 7.4）、0.3 mol/L NaCl、250 mmol/L咪唑。流速為1.0 mL/min，洗脫樣品時(shí)的洗脫液含16.7%B液[11]。

1.2.6 pro-TGase的體外活化及TGase酶活力測定向40 μL野生或突變pro-TGase發(fā)酵上清液中加入2 μL 的中性蛋白酶 dispase（0.1mg/mL），混合均勻，37 ℃水浴 10 min[12]。

比色法測定酶活[13]。L-谷氨酸-γ-單羥胺酸作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，α-N-CBZ-GLN-GLY為底物。1個(gè)單位的TGase酶活定義為：在37℃的條件下，每分鐘催化上述底物合成1 μmol的 L-谷氨酸-γ-單羥胺酸所用的酶量（U/mL）。酶活測定條件為37℃下反應(yīng)10 min，酶催化反應(yīng)見圖1。

1.2.7 TGase酶學(xué)參數(shù)測定 測定TGase酶反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)（Km、kcat）條件：溫度 37 ℃，底物質(zhì)量濃度范圍為0~30 g/L。通過Eadie-Hofstee方程計(jì)算可得動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值。

半衰期檢測（t1/2）：將純化后的突變TGase稀釋到同一質(zhì)量濃度，放置于50℃水浴保溫25 min，每隔3分鐘取樣測TGase酶殘余活力。蛋白質(zhì)的半衰期（t1/2）可通過作活力-時(shí)間的關(guān)系圖，由曲線末端直線部分的斜率（k）解得。

1.2.8 軟件分析 酶分子的折疊自由能變化值ΔΔG由 PoPMuSiC-2.1（http：//dezyme.com）計(jì)算。 利用 在 線 服 務(wù) 器 SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）， 以PDB數(shù)據(jù) S.mobaraensis pro-TGase（PDB No.3iu0A）[14]晶體結(jié)構(gòu)為模板，同源模擬S.hygroscopicusTGase晶體結(jié)構(gòu)。TGase晶體結(jié)構(gòu)由軟件Discovery studio分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變位點(diǎn)的選擇

PoPMuSiC-2.1可快速分析各氨基酸位點(diǎn)替換為其它氨基酸對(duì)應(yīng)TGase突變體的折疊能，并由此計(jì)算得到各氨基酸位點(diǎn)的折疊能變化值ΔΔG。利用PoPMuSiC-2.1對(duì)S.hygroscopicusTGase氨基酸序列進(jìn)掃描，得到了各氨基酸位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的ΔΔG之和，見圖2。一般認(rèn)為，ΔΔG值越小的氨基酸位點(diǎn)，突變后對(duì)酶分子熱穩(wěn)定性的提高越明顯[15]?；诖?，取TGase序列中ΔΔG之和最小的位點(diǎn)P132作為改造靶點(diǎn)，以期提高其熱穩(wěn)定性。為考察不同ΔΔG值對(duì)酶穩(wěn)定性的影響，擬將P132分別突變?yōu)楫惲涟彼幔≒132I）、谷氨酰胺（P132Q）、甘氨酸（P132G）及蛋氨酸（P132M）等，其ΔΔG依次增加，見表2。

2.2 TGase突變體的分泌表達(dá)

前期研究發(fā)現(xiàn)，TGase以酶原pro-TGase形式在鏈霉菌中表達(dá)，其N端前導(dǎo)肽對(duì)TGase大腸菌中的正確折疊有重要影響；在重組表達(dá)體系中，一般通過體外添加活化蛋白酶切割pro-TGase前導(dǎo)肽下得到成熟TGase[16]。在本研究中，以酶原pro-TGase的形式在大腸桿菌E.coliBL21（DE3）為宿主分泌表 達(dá) 了 TGase 及 突 變 體 （P132Q、P132I、P132G、P132M）。經(jīng)蛋白酶活化，表達(dá) P132Q、P132I、P132G、P132M的重組菌胞外TGase酶活分別較突變前提高了 115%、85%、71%和94%，見圖3（a）。蛋白質(zhì)電泳分析顯示，表達(dá)突變體的重組菌上清液的pro-TGase條帶（42 500）較改造前的重組菌明顯增粗，見圖3（b）。上述結(jié)果表明，重組 P132Q、P132I、P132G和P132M的pro-TGase在大腸桿菌中高效分泌。

圖2 S.hygroscopicus TGase氨基酸序列中的ΔΔG值Fig.2 ΔΔG value in S.hygroscopicus TGase sequence

表2 TGase突變體的ΔΔG值Table 2 ΔΔG value of TGase mutants

圖3 重組E.coli BL21（DE3）胞外TGase突變體酶活及SDS-PAGE電泳分析Fig.3 Activity and SDS-PAGE analysis of TGase mutants in culture supernatant of recombinant E.coli BL21（DE3）

2.3 重組TGase的純化以及酶學(xué)性質(zhì)分析

含突變體發(fā)酵的上清經(jīng)鎳柱分離后獲得電泳純的突變體（圖4），并分析了純酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果顯示，突變體P132I、P132G、P132Q和P132M在50℃下的半衰期t1/2較野生酶提高了2%~31%，其中P132I達(dá)到5.0 min，見表3。此外，P132I和P132G比酶活亦分別較野生酶提高24%和12.4%，其它突變比酶活變化不明顯。與比酶活變化相對(duì)應(yīng)，P132I和P132G的Km較野生酶降低，而kcat略有提高；P132M及P132Q的變化趨勢相反。上述結(jié)果表明，P132I和P132G熱穩(wěn)定性和催化活性相比野生酶有較為明顯的提高，進(jìn)一步增強(qiáng)了底物的親和力以及催化效率。

圖4 純化的pro-TGase及其突變體SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified pro-TGase mutants

表3 TGase及突變體的酶學(xué)性質(zhì)Table 3 Enzymatic properties of TGase and its mutants

2.4 P132I的穩(wěn)定化機(jī)制分析

研究表明，蛋白質(zhì)分子內(nèi)作用力的種類和數(shù)量對(duì)酶分子熱穩(wěn)定性和催化活性產(chǎn)生重要影響[17]。為解析TGase突變體P132I的分子機(jī)制，構(gòu)建了S.hygroscopicusTGase模擬結(jié)構(gòu)并分析了分子內(nèi)作用力的變化。P132處于酶分子內(nèi)部的loop結(jié)構(gòu)上，增加P132與其它基團(tuán)的作用力有利于提高loop結(jié)構(gòu)的剛性，進(jìn)而提高酶分子的熱穩(wěn)定性。作用力分析顯示，在野生TGase中，P132僅與S130和Y127形成兩個(gè)氫鍵；而在突變體P132I中，I132與S130和Y127形成了4個(gè)氫鍵，見圖5。氫鍵是酶分子穩(wěn)定的重要作用力之一，一個(gè)氫鍵可為蛋白質(zhì)的維持提供0.6 kcal/mol的能量[18]。因此，P132I熱穩(wěn)定性提高的原因之一極有可能是因?yàn)闅滏I的增加[19]。

圖5 S.hygroscopicus TGase模擬結(jié)構(gòu)Fig.5 Modeling structure of S.hygroscopicus TGase

除此之外，在突變株P(guān)132I中，132位異亮氨酸較野生酶中的脯氨酸疏水性更強(qiáng)。大量的研究顯示，降低蛋白質(zhì)表面的疏水性或增加蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性，能夠提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[20-21]。如有研究者將乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase）表面疏水氨基酸L471突變成親水性更高的酪氨酸，酶熱穩(wěn)定性提高了3倍[22]。因此，分子內(nèi)部疏水性的提高，也可能是導(dǎo)致P132I熱穩(wěn)定提高的另一原因。

圖6 TGase及突變體分子中132氨基酸形成的氫鍵Fig.6 Hydrogen bond formed by amino acid 132 in TGase and its mutants

3 結(jié)語

TGase應(yīng)用廣泛，包括紡織、食品、造紙和環(huán)境領(lǐng)域等。然而，其應(yīng)用的推廣卻受限于其較低的熱穩(wěn)定性。本研究通過折疊能分析軟件PoPMuSiC-2.1發(fā)現(xiàn)了S.hygroscopicusTGase分子中ΔΔG最小的位點(diǎn)P132，確定該位點(diǎn)為提高TGase熱穩(wěn)定性的潛在位點(diǎn)。在構(gòu)建得到的突變體中，P132I的50℃半衰期和比酶活分別較野生酶提高31%和24%，這個(gè)結(jié)果表明，基于折疊能分析的定點(diǎn)突變策略能有效地提高TGase的熱穩(wěn)定性。在下一步研究中，將使用構(gòu)建P132I高效分泌表達(dá)系統(tǒng)，以期實(shí)現(xiàn)高熱穩(wěn)定性和高催化活性TGase工業(yè)化生產(chǎn)。