趙曉曼， 周長(zhǎng)濤， 魏云林， 季秀玲

（昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

地球表面生物圈中超過(guò)80%的區(qū)域溫度均低于5℃，海洋的大部分區(qū)域其水溫低于5℃[1]；而在南北兩極平均溫度僅為-1.8℃ ，絕大多數(shù)土壤的溫度即使在夏季也不會(huì)超過(guò)10℃[2]。這些低溫環(huán)境中生存著大量低溫微生物，冷適應(yīng)細(xì)菌在低溫條件下的生存能力使得它們?cè)谏鷳B(tài)學(xué)方面比嗜溫菌更有優(yōu)勢(shì)[3]，冰川被認(rèn)為是研究宇宙生命進(jìn)化和地球環(huán)境演化等重大問(wèn)題的“活化石”，同時(shí)也是一個(gè)多元化和動(dòng)態(tài)的微生物“儲(chǔ)藏庫(kù)”。國(guó)內(nèi)外冰川細(xì)菌研究方向主要為：新種的發(fā)現(xiàn)[4]、適冷機(jī)制[5]、固氮機(jī)制[6]和冰川細(xì)菌相關(guān)產(chǎn)物如抗凍蛋白、低溫酶等[7]?？梢哉f(shuō)冰川微生物的研究只處于起始階段，還有很長(zhǎng)的路要走。然而據(jù)2010年世界冰川監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)關(guān)于冰川融化的最新評(píng)估顯示，冰川消融速度是2000年的2倍，冰川中獨(dú)特而稀有的微生物菌種可能在未被人類初識(shí)前就因冰川消融瀕危[8]。本研究對(duì)明永冰川低溫微生物多樣性的初步研究獲得了一批重要的菌種資源，為尋找有應(yīng)用價(jià)值的產(chǎn)低溫酶菌株、了解該地區(qū)低溫微生物多樣性奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，瓊脂 20；pH 7.2。

LB液體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10；pH 7.2。

營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂（g/L）：蛋白胨 5，牛肉膏 1，NaCl 5，瓊脂 15；pH 7.0~7.2。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 5，（NH4）SO42，檸檬酸鈉 1，K2HPO4·3H2O 14，KH2PO46， 瓊脂 20；pH 7.0。

1.2 樣品采集和低溫細(xì)菌的分離及形態(tài)學(xué)特征觀察

1.2.1 樣品采集和低溫細(xì)菌的篩選與分離 本研究樣品采樣點(diǎn)位于云南省明永冰川 （N28°27′，E98°48′）。在實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備好固體培養(yǎng)基帶到明永冰川。在明永冰川的冰舌地區(qū)采集冰、冰川退卻地區(qū)土壤、融冰水、冰片和少量土壤塵?；旌蠘樱?5份樣品，每個(gè)平板均勻的鋪灑約0.1 g樣品后立即用封口膜密封。所有的樣品在被運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室之前都置于4~8℃保存?；氐綄?shí)驗(yàn)室后，土樣用土壤懸浮涂布法篩選分離：稱取少量土樣于滅菌三角瓶中，加入約100倍于土樣質(zhì)量的無(wú)菌水，取土壤稀釋液涂布LB平板。水樣、冰樣直接平板劃線，后均置于13℃培養(yǎng)一周，培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)三次劃線分離純化，并觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 運(yùn)動(dòng)性觀察 在潔凈載玻片上加一滴無(wú)菌水，挑取一環(huán)菌液與水混合，再加一環(huán)0.01%的美藍(lán)水溶液與其混合均勻。用鑷子取一潔凈蓋玻片，使其一邊與菌液邊緣接觸，然后將蓋玻片慢慢放下蓋在菌液上，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)細(xì)菌之間出現(xiàn)明顯的位移的為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.3 菌株的生理生化特性研究

1.3.1 菌株生長(zhǎng)溫度范圍 22株菌株使用4、15、25、37℃四個(gè)溫度梯度，培養(yǎng)48 h后以未接種的新鮮培養(yǎng)基做陰性對(duì)照，然后測(cè)光吸收度OD600，重復(fù)3次。

1.3.2 抗生素抗性實(shí)驗(yàn) 接種10 μL新鮮培養(yǎng)的菌液于含不同質(zhì)量濃度 （氨芐青霉素50 μg/mL；卡那霉素50 μg/mL；慶大霉素 7 μg/mL；四環(huán)素10 μg/mL）抗生素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，pH 7.0，于13℃、150 r/min培養(yǎng)36 h，觀察菌株對(duì)抗生素的抗性。

1.3.3 對(duì)不同底物的分解能力 挑取單菌落接種于選擇性橄欖油，干酪素和淀粉培養(yǎng)基上，于15℃培養(yǎng)48 h后觀察降解情況。

1.3.4 氧化酶實(shí)驗(yàn) 用濾紙沾取菌落，滴一滴1%的對(duì)氨基二甲基苯胺鹽酸鹽，呈粉紅色，再滴加一滴5%的α-奈酚溶液，若在30 s變成藍(lán)色，為陽(yáng)性反應(yīng)，若在2 min內(nèi)不變藍(lán)色，則為陰性反應(yīng)。

1.4 16S rRNA的PCR擴(kuò)增

利用16S rRNA基因的一對(duì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 引物：F 5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3′和R 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′由英俊生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：10×Ex-Taq buffer 5 μL ，2.5 mmol/l dNTP 3 μL， 模板 10 ng， 正向引物各 50 pmol，Ex-Taq DNA polymerase 0.2 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足至 50 μL。 PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃變性 30 s，50 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.5 DNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

DNA產(chǎn)物純化后，與pMD19-T載體（Takara）16℃連接過(guò)夜，取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。 以 M13（RV/M4）為引物（北京三博遠(yuǎn)志公司合成）檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增驗(yàn)證的產(chǎn)物由北京三博遠(yuǎn)志公司測(cè)序部進(jìn)行雙向測(cè)序，然后將所測(cè)序列提交 GenBank，通過(guò) Blast（Ver2.2.14）進(jìn)行序列同源性檢索分析。選取同源性比較高的典型菌株的16S rRNA基因序列作為參比對(duì)象，然后用CLUSTAL X軟件[9]進(jìn)行多序列比對(duì)并計(jì)算供試菌株與參比菌株之間的序列相似性，采用鄰位相接法 （Neighbor-Joining），應(yīng)用MEGA 6.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌分離純化結(jié)果

作者分離純化到500多株細(xì)菌，通過(guò)菌形態(tài)、顏色等選出22株細(xì)菌做進(jìn)一步的研究，22株細(xì)菌編號(hào)、菌落及菌體形態(tài)特征見(jiàn)表1。

表1 菌株編號(hào)、菌落及菌體形態(tài)特征Table 1 Strains number，colony and cell morphology characteristics

2.2 菌株生理生化特性

22珠菌在4、15、25℃幾乎均能生長(zhǎng)，37℃時(shí)僅一株菌能生長(zhǎng)，判定菌株MY14011屬于嗜冷菌，其余21株菌屬于耐冷菌；所有菌株均有氨芐青霉素抗性，對(duì)卡那霉素和四環(huán)素敏感，部分對(duì)慶大霉素敏感；22株菌均無(wú)淀粉酶和脂肪酶活性，多數(shù)菌株有蛋白酶水解活性；大部分菌株氧化酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，見(jiàn)表2。

表2 22株細(xì)菌生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical properties of 22 strains

2.3 分子鑒定結(jié)果

分離菌株P(guān)CR擴(kuò)增出的16S rDNA片斷條帶單一，大小約為1 500 bp，連接pMD19-T載體，測(cè)序后提交 NCBI，通過(guò) Blast（Ver2.2.14）比對(duì)進(jìn)行分離菌株的初步鑒定。將所得菌株序列與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行同源性檢索分析，并選取同源性高的菌株利用ClustX和Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖1。

圖1 22株菌與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of the 22 strains and their relatives

22株菌在進(jìn)化樹(shù)上分布在四個(gè)簇群中，其中菌株MY14011與Chromobacterium fluciative的同源性最高；菌株MY0504與Flavobacterium屬的親緣關(guān)系最近；菌株MY14015和MY1413與Arthrobacter屬劃分在同一簇群中；其余的18株菌株均歸屬于Pseudomonas屬。

作者采用傳統(tǒng)的微生物分離純化法從明永冰川冰舌地區(qū)分離純化獲得22株可培細(xì)菌。根據(jù)16S rRNA基因序列分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析和部分生理生化特性結(jié)果表明：菌株MY0504與Flavobacterium pectinovorumDSM6368（AM230490）親緣關(guān)系最近（97.6%），具有蛋白酶活性和氨芐抗性；菌株MY1413和 MY14015分別與Arthrobacter psychrophenolicusDSM1545T （AJ616763） 和Arthrobacter parietesLMG22281T（AJ639830）有很近的親緣關(guān)系（98%），具有氨芐抗性；MY14011歸屬于色桿菌屬，與河流色桿菌Chromobacterium fluviatile進(jìn)化關(guān)系最近（97%），具有蛋白酶活性和氨芐抗性，可能為潛在新種，但需要進(jìn)一步做分子雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；其余18株菌均鑒定為假單胞菌屬的菌株。

低溫環(huán)境中細(xì)菌是數(shù)量和種類最多，目前從低溫環(huán)境中分離得的微生物大多為耐冷菌，嗜冷菌所占比例較小，其中屬于革蘭氏陰性的Pseudomonas屬和革蘭氏陽(yáng)性的Bacillus屬較多[10]。和天山一號(hào)冰川類似[11]，在分離的22株菌種明永冰川假單胞菌屬 （Pseudomonas）屬于的優(yōu)勢(shì)菌株。黃桿菌屬（Flavobacterium）廣泛分布于土壤、淡水、海洋和極地環(huán)境中[12]，因其生長(zhǎng)環(huán)境多樣，具較高的蛋白酶活性，將為商品蛋白酶的開(kāi)發(fā)利用提供有力的菌種資源庫(kù)[7]。從2003年到2013年，周培謹(jǐn)和周宇光團(tuán)隊(duì)在中國(guó)1號(hào)冰川和海螺溝冰川分離出了Flavobacterium屬的7個(gè)新種[13]。外籍華人Dechao Zhang從中國(guó)一號(hào)冰川分離到的Flavobacterium屬的一個(gè)新種[14]。作者也從明永冰川分離到一株黃桿菌屬（Flavobacterium）的菌株MY0504。迄今尚沒(méi)有在冰川地區(qū)分離到Chromobacterium的相關(guān)報(bào)道，分析原因可能是，河流色桿菌是一種在亞熱帶和熱帶地區(qū)的水與土壤中存在的革蘭氏陰性桿菌，明永冰川獨(dú)特的低緯度熱帶季風(fēng)氣候和靠降水而生存的特點(diǎn)，使得能在冰川中分離到Chromobacterium屬細(xì)菌，這為進(jìn)一步研究冰川這一特殊區(qū)域的微生物與氣候環(huán)境變化的關(guān)系提供了方向。

3 結(jié)語(yǔ)

研究明永冰川這一特殊生態(tài)環(huán)境下的低溫微生物多樣性，不僅有助于了解這一特殊地理?xiàng)l件及生態(tài)環(huán)境下的微生物群落演替規(guī)律，而且也對(duì)了解微生物―植被―土壤這一系統(tǒng)對(duì)全球氣候變化的影響有極其重要的理論意義[15]。當(dāng)下酶制劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景廣闊，對(duì)低溫酶的開(kāi)發(fā)和利用具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[16]。