王道余， 趙勝娟， 劉 燕， 劉 淼， 馮利興*

（1.復旦大學 生命科學學院，上海 200433；2.河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；3.中國科學院上海藥物研究所，上海 201203）

肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康。近年來對腫瘤轉移機制的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤轉移過程中有多個因素參與轉移調控，是一個非常復雜的過程[1]。肝癌細胞的侵襲和轉移是肝癌治療失敗和患者致死的主要原因，了解肝癌的轉移機制是十分關鍵而又迫切的需求。

在腫瘤侵襲轉移過程中，腫瘤細胞侵犯并穿過基底膜及細胞外基質所組成的屏障，而蛋白酶（Cathepsin）在其中扮演了一個重要的角色[2]。組織蛋白酶是具有降解正常細胞蛋白質功能的半胱氨酸蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶家族。目前在許多組織中鑒定出了超過12種不同的種類，其中組織蛋白酶B（Cathepsin B）尤為重要，它與腫瘤的侵襲和轉移密切相關[3-4]。研究表明，在許多侵襲性腫瘤或已經(jīng)發(fā)生轉移的腫瘤中，組織蛋白酶B是過量表達的，尤其在惡性腫瘤的細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）中更為明顯[5-7]。組織蛋白酶B可以與胱蛋白（cystatins）以及膜聯(lián)蛋白四聚物（S100A10）相互作用，通過蛋白質水解激活ECM元件，進一步降解ECM，腫瘤細胞可以更好的移動并穿過細胞外基質和血管壁進入血液循環(huán)，從而在腫瘤侵襲轉移中發(fā)揮重要作用[3，8]。目前，越來越多的文獻指出，組織蛋白酶B可能是腫瘤治療的一個有效靶點[3，9-11]，對其作用網(wǎng)絡的研究顯得尤為重要。

酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核細胞中研究蛋白質-蛋白質相互作用的一種非常有效的技術。該系統(tǒng)采用的酵母轉錄因子是特殊設計的，其DNA結構域和DNA激活域是分離的，分別將其與誘餌蛋白和靶蛋白連接在一起，只有當誘餌蛋白與靶蛋白發(fā)生相互作用時，DNA結構域和DNA激活域發(fā)生空間接近，轉錄因子調控區(qū)下游的報告基因才能激活表達，因此根據(jù)報告基因是否表達，可以判斷誘餌蛋白與靶蛋白之間是否存在相互作用。通過篩選特定的表達文庫來尋找與靶蛋白相互作用的蛋白質，對于制作大規(guī)模蛋白質互作網(wǎng)絡圖而言，酵母雙雜交技術也是一個有力的工具[12]。在本研究中，我們采用人組織蛋白酶B作為誘餌蛋白，試圖尋找其在腫瘤細胞中的直接相互作用蛋白。

1 材料與方法

1.1 質粒、載體和宿主菌

采用Clontech酵母雙雜交系統(tǒng)。誘餌載體pGBKT7：購自Clontech公司；誘餌基因pGBKT7-CTSB：作者所在實驗室制備保存；靶載體pGADT7：購自Clontech公司；靶基因pGADT7-HepG2-cDNA文庫：作者所在實驗室自制；宿主菌AH109釀酒酵母：購自Clontech公司；DH5α感受態(tài)：作者所在實驗室自制保存。

1.2 培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基（LB）：0.5 g/dL酵母提取物，1 g/dL 多聚蛋白胨；1 g/dL NaCl，pH 7.0。

酵母完全培養(yǎng)基（YPDA）：1 g/dL酵母提取物，2 g/dL蛋白胨，2 g/dL葡萄糖，0.02 g/dL腺嘌呤。

酵母缺陷型篩選培養(yǎng)基：參照Clontech公司的Yeast Protocols Handbook。

其中各種培養(yǎng)基分別以下列符號表示：SD-T：-trp；SD-TL：-trp，-leu；SD-TLH：-trp，-leu，-his；SDTLHA：-trp，-leu，-his，-ade。

1.3 誘餌質粒構建及轉化酵母菌株

CTSB擴增：以pMD18T-CTSB質料為模板，運用CTSB特異性引物對其進行PCR擴增 （引物F：5'－AAGGCCATTACGGCCATGTGGC AGCTCTGGG CCTCC－3'；R：5'－CCGGCCGAGGCGGCCTTAGATCT TTTCCCAGTACTGATCGGTG－3'）。PCR反應條件：首先94℃預變性3 min；其次94℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；最后 72 ℃延伸 10 min。

PCR產(chǎn)物回收并酶切：酶切體系為SfiI 1 μL、10×buffer 2 μL、100×BSA 0.2 μL、PCR 產(chǎn)物 17 μL，在50℃混合孵育5 h。

目的片段回收后與載體連接：T4連接反應體系為 T4 1 μL，T4 buffer 1 μL，pGBK7/SfiI 2 μL，CTSB 5 μL 加水 1 μL 至總體積為 10 μL，16 ℃連接過夜。

重組載體鑒定：重組載體轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂布于卡那霉素陽性平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取10個單克隆過夜培養(yǎng)后提取質粒，經(jīng)酶切及測序鑒定，確定讀碼框序列是否正確。

1.4 誘餌蛋白自我轉錄激活檢測

自我轉錄激活檢測采用PEG/LiAC轉化法，將誘餌質粒pGBKT7-CTSB轉入AH109酵母菌株。設pGBKT7-p53/pGADT7-largeT為陽性對照，pGBKT7-laminC/pGADT7-largeT為陰性對照。HIS3和ADE2的檢測采用點板培養(yǎng)的方法，將轉化子點板至SD-TLHA平板，30℃恒溫培養(yǎng)4 d，觀察其生長狀態(tài)，同時檢測誘餌蛋白對LacZ報告基因是否存在轉錄激活作用。如果轉化誘餌質粒的酵母菌落在SD-TLHA平板上無法生長，同時也不會在LacZ檢測中使底物X－Gal變藍，表明無自激活，否則存在自激活。

1.5 酵母雙雜交文庫篩選

用含有正確pGBKT7-CTSB誘餌質粒的AH109酵母轉化子作為受體菌制備感受態(tài)，將文庫質粒pGADT7-HepG2-cDNA轉入其中，涂SD-Trp-Leu-His+5 mmol/L 3AT平板。

文庫DNA轉化方法：從SD-T平板挑取含有pGBKT7-CTSB誘餌質粒的AH109酵母轉化子單菌落一個，接種于液體SD-T培養(yǎng)基50 mL，30℃、225 r/min振蕩培養(yǎng)18 h。轉接于YPDA液體500 mL， 使初始OD600為0.2，30℃、225 r/min振蕩培養(yǎng)4~5 h，至OD600為0.6。離心收集菌體，室溫下4 000 r/min離心5 min。用30 mL無菌水重懸菌體，混勻，離心收集菌體，室溫下4 000 r/min離心5 min，棄上清液。用20 mL、0.1 mol/L LiAc重懸菌體，混勻，離心收集菌體，室溫下4 000 r/min離心5 min，棄上清液。用10 mL 0.1 mol/L LiAc重懸菌體，混勻，離心收菌，室溫下4 000 r/min離心5 min，棄上清液。向離心管中依次加入9.6 mL 50%PEG3350，1.44 mL 1 mol/L LiAc，300 μL ssDNA （10 mg/mL），25 μg 文庫質粒DNA，用槍頭吹打混勻，或劇烈振蕩1 min左右，至完全混勻。30℃水浴孵育30 min，42℃水浴熱激25 min，30℃水浴復蘇1 h。離心收菌，室溫下4 000 r/min離心5 min，棄上清液，用10 mL無菌水重懸菌體，盡量溫和地混勻，從中取20 μL培養(yǎng)物經(jīng)梯度稀釋后涂SD-TL平板3塊，用于檢測文庫轉化效率。其余涂SD-TLH+5 mmol/L 3AT平板，每塊 200 μL，共 50塊。30 ℃恒溫培養(yǎng) 3~4 d，觀察轉化結果，記錄轉化效率。根據(jù)效率平板的轉化子數(shù)量，計算篩庫效率。

為了消除背景生長菌落的干擾，在培養(yǎng)到第3天時，用絨布對篩庫平板進行影印清除后，繼續(xù)培養(yǎng)7~14 d。分批挑取再次長出的轉化子菌落進行下一步檢測。至影印清除后繼續(xù)培養(yǎng)7 d，從篩庫平板中挑取長出的陽性克隆單菌落，共挑取到84個初始陽性克隆轉化子轉接到SD-TL缺陷型平板中繼續(xù)培養(yǎng)2~3 d。將上述SD-TL缺陷型平板上長出的84個初始陽性克隆轉化子分別用無菌水稀釋后點種至SD-TL和SD-TLHA缺陷平板，30℃恒溫培養(yǎng)3~4 d后觀察結果。同時將84個初始陽性克隆用無菌水重懸后點于濾紙片上進行LacZ報告基因檢測。

1.6 陽性克隆驗證

對上述篩選的陽性克隆進行質粒提取，再次轉化后進行抗性篩選和質粒抽提，然后分別與誘餌質粒共轉酵母細胞AH109驗證，再次陽性者提取提質粒進行測序鑒定。

1.7 生物信息學分析

將測序得到的序列信息，采用NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）對測序所得到的序列進行BLAST分析。

2 結果與討論

2.1 誘餌質粒的構建

從上述每個連接體系轉化平板上，隨機挑取4個大腸桿菌轉化子接種于帶卡那抗性的液體LB培養(yǎng)基，于37℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)16 h（過夜）后，用質粒引物進行PCR擴增，見圖1。對擴增得到陽性條帶的克隆各選取兩個（編號為1、2）進行質粒抽提（Axygen質粒小量抽提試劑盒）和測序，插入片段測序結果經(jīng)比對確認正確。

2.2 誘餌蛋白自激活檢測

對照菌株在SD-TL缺陷平板上都能正常生長，而僅有陽性對照可在SD-TLHA缺陷平板生長。pGBKT7-CTSB+pGADT7轉化子中隨機挑選的6個菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生長，生長狀態(tài)同陰性對照，LacZ檢測中結果也與陰性對照相同，因此不存在自激活。pGBKT7-CTSB誘餌克隆沒有自激活作用，可用于進行文庫篩選，見圖2。

2.3 文庫構建和篩選

使用一種獨特的高質量的文庫構建方法，以獲得高質量的酵母雙雜交文庫。主要流程為：Trizol法RNA的提取，mRNA的分離，第一鏈cDNA的合成，全長mRNA的富集和第二鏈的合成，DSN均一化處理，cDNA長度分級，Gateway BP重組和電轉化，質粒提取，Gateway LR重組到pGADT7載體和電轉化，酵母雙雜交文庫質粒提取，就可以得到全長均一化的高質量酵母雙雜交文庫。

圖2 自激活檢測結果Fig.2 Result of self-activation

根據(jù)酵母轉化效率平板的轉化子數(shù)量，計算篩庫效率，為9.4×105cfu/gDNA，轉庫效率達標，可以進行文庫篩選，見圖3。

圖3 文庫轉化效率Fig.3 Efficiency of library transformation

然后從篩庫平板上挑取84個單克隆，進行His、Ade和LacZ報告基因實驗進一步篩選，因為只有能通過3個報告基因檢測才可被判定與誘餌蛋白具有相互作用。在ADE2和HIS3報告基因的檢測結果中，可以看到，陽性對照在SD-TL和SD-TLHA都能正常生長，而陰性對照由于不會激活ADE2和HIS3報告基因，在SD-TL可以正常生長，但在缺少His和Ade這兩種氨基酸的SD-TLHA平板上不能生長。因此，在84個初始陽性克隆中，能在SDTLHA生長的是激活了His和Ade報告基因。本實驗文庫篩選得到的84個初始陽性克隆中共有15個能通過3個報告基因的檢測，編號分別為：1、2、3、4、5、7、14、15、24、38、52、58、73、80、81，見圖 4。

圖4 陽性克隆His、Ade和LacZ報告基因檢測Fig.4 Report gene analysis of positive clone

將這些陽性克隆提取質粒并轉入大腸桿菌DH5a中，再次進行抗性篩選，從中再次提取質粒而獲得文庫質粒。最終獲得15個克隆，質粒提取后進行測序分析。

2.4 生物信息學分析

將15個陽性克隆測序并BLAST分析，在GenBank數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)對應7個不同的基因，編碼7種已知的蛋白質，分別是：BCL2-associated athanogene 6 （BAG6）、filamin A，alpha（FLNA）、ras homolog family member G （RHOG）、metallothionein 2A （MT2A）、ZXD family zinc finger C（ZXDC）、DEP domain containing 7（DEPDC7）和 A kinase（PRKA）interacting protein 1（AKIP1）。

3 結語

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CTSB可以和7個蛋白質發(fā)生直接結合，其中包括BAG6。BAG（Bcl-2 associated athanogene）家族是細胞凋亡調控蛋白質家族，是上世紀90年代初發(fā)現(xiàn)的。BAG是多功能蛋白質，能夠和熱激蛋白、信號分子、抗細胞凋亡蛋白Bcl-2、核激素受體等多種細胞成分發(fā)生作用，BAG6是BAG家族成員之一。BAG6同樣參與了大量生理和病理進程，包括凋亡、抗原呈遞和T細胞相應等，而且可以調節(jié)新生多肽鏈的質量控制[13]。此外，BAG6和Scythe、Bat3一起作為HSP70的協(xié)同伴侶分子，共同參與多種生物學進程，包括細胞應激和活力等[14]。通過TRC通路調節(jié)蛋白酶體的組裝，BAG6可以影響蛋白酶體的作用[15]。BAG6還可以清除錯誤定位的蛋白質[16]。而CTSB與BAG6直接結合，可能是其發(fā)揮相應生物學功能的基礎，有必要進一步研究其結合的方式以及具體參與了哪些進程。

細絲蛋白A（filamin A，F(xiàn)LNA）是非肌性肌動蛋白結合蛋白，相對分子質量約280 000，又名ABP-280。能結合多種細胞膜蛋白及信號蛋白，可以調控細胞骨架的重排和細胞形態(tài)。FLNA可以參與RalA誘導的絲狀偽足[17]及Trio、PAK1誘導的包膜邊緣波動[18-19]。FLNA可以與微絲相互作用形成細胞骨架，為細胞提供機械強度，并支持細胞形態(tài)改變，因而能促進腫瘤的轉移。FLNA也可以通過其與小GTPase家族成員R-Ras作用促進細胞遷移[20]。

RHOG（ras homolog family member G）是 Rho蛋白質家族成員，通過與GDP結合或GTP結合來調節(jié)失活或激活狀態(tài)，從而在信號級聯(lián)中扮演分子開關的角色。Rho家族蛋白可以驅動actin骨架重排調節(jié)，調控細胞形狀、粘附和運動。敲除RHOG可以顯著抑制惡性膠質瘤細胞的的侵襲行為，而且抑制Rac1 的激活[21]。

人金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）相對分子質量約6 000 000～7 000 000，在哺乳類動物中已發(fā)現(xiàn)四個 MT 組分：MT-1、MT-2、MT-3 及 MT-4。 而MT-2A是MT-Ⅱ亞型中惟一具有生物學作用的蛋白質[22]。MT-2A具有抗輻射、重金屬解毒、清除自由基、修復組織損傷、調節(jié)微量元素平衡及抗衰老等作用，還與細胞的增殖、凋亡及腫瘤耐藥密切相關，而且大量的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中MT-2A的高表達與腫瘤的惡性程度及浸潤深度呈正相關[23]。

ZXDC屬于ZXD轉錄因子家族成員，可以調節(jié)MHC基因家族的轉錄[24]。DEPDC7作為CARMA的相互作用分子，對于激活G蛋白歐聯(lián)受體后特異性傳輸CBM復合物信號是很關鍵的[25]。此外，它還可以調節(jié)NF-kB信號的激活[25]。而AKIP1也可以調節(jié)NF-kB信號通路[26-27]，進一步還可以調節(jié)腫瘤的血管生成[28]。

研究發(fā)現(xiàn)，在侵襲性腫瘤中蛋白酶的活性會高表達，包括CTSB[29]。許多臨床研究策略嘗試采用抑制蛋白酶活性來控制蛋白酶介導的腫瘤細胞轉移性滲透?？紤]到CTSB對于腫瘤細胞的保護作用，目前針對CTSB的抑制劑進行了大量研究工作，發(fā)現(xiàn)抑制CTSB活性可以顯著推遲腫瘤的生長[30]。我們通過酵母雙雜交技術發(fā)現(xiàn)了CTSB直接相互作用的蛋白質，這些蛋白質對于了解CTSB作用網(wǎng)絡非常重要，有利于開發(fā)新型CTSB抑制劑。近年來從中藥中篩選到許多高效的抗腫瘤單體化合物，包含了大量新型抑制劑，將是一個巨大的寶藏，等待人們去進一步挖掘[31-32]。