劉曉筱 ， 張 娟 *， 陳 堅(jiān) ， 堵國成

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

葡 萄 糖 氧 化 酶 （β -D-glucose：oxygen 1-oxidoreductase；EC 1.1.2.3.4，GOD）是一種黃素糖蛋白[1]，其催化反應(yīng)專一性較強(qiáng)，對β-D-葡萄糖有高度的專一性。葡萄糖氧化酶分子為二聚體，含有兩個亞基，相對分子質(zhì)量約為130 000~170 000[2]，每個亞基可結(jié)合一個FAD分子，因此每個酶分子有兩個FAD結(jié)合位點(diǎn)。GOD是一種需氧脫氫酶，以氧為電子受體，能專一地將β-D葡萄糖氧化為葡萄糖酸，氧被還原生成過氧化氫（H2O2）[3]。從GOD催化葡萄糖氧化反應(yīng)的機(jī)理可以看出，輔酶FAD從β-D葡萄糖奪走兩個H原子形成還原態(tài)輔酶FADH2[4]，同時β-D葡萄糖被氧化生成δ-葡萄糖酸內(nèi)酯，隨后δ-葡萄糖酸內(nèi)酯水解生成δ-葡萄糖酸，還原態(tài)的GOD被氧化成氧化態(tài)的GOD并生成H2O2[5-6]，見圖1。

圖1 GOD催化反應(yīng)β-D葡萄糖機(jī)理示意圖Fig.1 Catalytic reactions of β-D glucose mediated by GOD

葡萄糖氧化酶是酶技術(shù)領(lǐng)域中最主要的工具酶之一，因其可以與氧和葡萄糖發(fā)生催化反應(yīng)，而被廣泛應(yīng)用于食品[7-9]、飼料、醫(yī)藥等眾多相關(guān)領(lǐng)域[10-11]，在面制品、啤酒生產(chǎn)、牛奶生產(chǎn)以及食品除氮抗氧化等領(lǐng)域有著極其重要的作用和巨大的市場需求[12]。

葡萄糖氧化酶的工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)主要采用黑曲霉[13]和青霉菌株[14]，但黑曲霉和青霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量雜蛋白質(zhì)對后期的分離純化工作造成很大的困難，且大大增加了生產(chǎn)成本。在傳統(tǒng)技術(shù)領(lǐng)域，葡萄糖氧化酶的生產(chǎn)菌株一直通過物理方法如紫外線、γ射線和化學(xué)方法如亞硝基胍等誘變方法進(jìn)行篩選。2000年以后，通過基因工程和分子生物學(xué)技術(shù)，不同來源的GOD基因已成功在同源、異源宿主細(xì)胞中得到克隆、測序和表達(dá)[15-16]。然而，這些重組菌在生產(chǎn)過程中抗生素或誘導(dǎo)劑的添加，給GOD在食品領(lǐng)域的應(yīng)用帶來了安全隱患?？傮w而言，已構(gòu)建重組菌生產(chǎn)的GOD尚不能滿足食品加工領(lǐng)域?qū)Π踩缘囊蟆Ｒ虼?，?gòu)建食品級的表達(dá)體系是迫切需要的。

Y.lipolytica在1942年首次被分離得到，是研究最為廣泛的非常規(guī)酵母之一，可應(yīng)用于生產(chǎn)有機(jī)酸、酶（蛋白酶、脂肪酶、酯酶及磷酸酶）、單細(xì)胞蛋白及單細(xì)胞油脂等。Y.lipolytica曾經(jīng)作為關(guān)于生理學(xué)、遺傳學(xué)、二態(tài)性、基因控制、蛋白質(zhì)表達(dá)及脂質(zhì)積累研究的模式系統(tǒng)[17]。Y.lipolytica可利用葡萄糖、乙醇、乙酸及疏水性基質(zhì)（如烷類、脂肪酸類及油）等作為碳源，且可分泌有機(jī)酸及蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物。20世紀(jì)末，人們將其開發(fā)成一種具有異源蛋白表達(dá)潛力的新型優(yōu)良酵母表達(dá)系統(tǒng)。近年來，Y.lipolytica作為異源蛋白表達(dá)宿主的研究進(jìn)展很快[18]。Y.lipolytica自身具備對常用抗生素的抗性，應(yīng)用中一般選擇營養(yǎng)型標(biāo)記，如LEU2、URA3，這樣避免了抗生素基因帶來的安全性問題[19]。目前，Y.lipolytica被認(rèn)為是非致病性的，F(xiàn)DA將其劃定為Generally Regarded As Safe（GRAS），可以用于食品和藥物生產(chǎn)領(lǐng)域。

作者將Aspergillus niger BBE11721葡萄糖氧化酶基因在解脂耶氏酵母中進(jìn)行表達(dá)，宿主為符合食品安全要求的營養(yǎng)缺陷型Yarrowia lipolytica菌株，構(gòu)建了一株高效分泌GOD的重組菌Yarrowia lipolytica 1-28。該重組菌發(fā)酵過程無需添加抗生素，無甲醇誘導(dǎo)，食品安全性較高。通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)對Yarrowia lipolytica 1-28生產(chǎn)GOD的發(fā)酵培養(yǎng)基在搖瓶水平進(jìn)行了優(yōu)化，并在3 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了初步的發(fā)酵條件探索，為后續(xù)工業(yè)化的開發(fā)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

E.coliJM109用于構(gòu)建和增值重組質(zhì)粒；質(zhì)粒pPIC9K/GOD用于Aspergillus niger葡萄糖氧化酶基因擴(kuò)增的模板；Y.lipolyticaPo1h （Ura-，△AEP，△AXP，Suc+）為表達(dá)宿主；質(zhì)粒pINA1297用于構(gòu)建重組載體。以上均由江南大學(xué)生物工程學(xué)院生物系統(tǒng)與生物加工工程研究室提供。

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（g/L）：氯化鈉 10，蛋白胨 10，酵母粉 5。

YPD 培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母粉10。

YNB 培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20，YNB1.7，硫酸銨 5。

PPB 培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖 20，酵母提取物 1.32，氯化銨1.32，磷酸二氫鉀0.32，無水硫酸鎂0.132，維生素B13.34×10-4；溶于pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液中[20]。

固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加2 g/dL瓊脂粉。

1.3 培養(yǎng)方法

Y.lipolytica種子培養(yǎng)條件：從-80℃保藏的工程菌甘油管點(diǎn)至YPD固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)過夜，用接種針挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)18~24 h，轉(zhuǎn)速為200 r/min。

Y.lipolytica發(fā)酵培養(yǎng)條件：采用PPB培養(yǎng)基，接種體積分?jǐn)?shù)為10%，于28℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。

3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件：罐裝液量1.0 L（優(yōu)化后PPB培養(yǎng)基），接種體積分?jǐn)?shù)10%，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，通氣量2.0 vvm。當(dāng)溶氧第一次反彈且大于60%時開始流加50 g/dL甘油，并調(diào)整轉(zhuǎn)速600~800 r/min以維持溶氧不高于30%。

1.4 DNA操作

1.4.1 質(zhì)粒DNA提取 使用從上海生物工程公司購買的質(zhì)粒提取試劑盒完成質(zhì)粒提取，實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書進(jìn)行。

1.4.2 限制性酶切反應(yīng) 限制性酶切反應(yīng)使用從TaKaRa公司購買的限制性內(nèi)切酶完成，實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書進(jìn)行。

1.4.3 DNA片段回收 DNA片段的回收使用從TaKaRa公司購買的膠回收試劑盒完成，實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書進(jìn)行。

1.4.4 DNA定點(diǎn)突變方法 DNA定點(diǎn)突變引物設(shè)計(jì)及操作使用從TaKaRa公司購買的突變試劑盒完成，實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書進(jìn)行。

1.4.5 酵母基因組提取 酵母基因組的提取使用從北京天根公司購買的酵母基因組提取試劑盒，實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書進(jìn)行。

1.4.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化方法 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備采用TaKaRa公司兩步法試劑盒制備。

1.4.7Y.lipolytica感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[21]進(jìn)行Y.lipolytic感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化。

1.5 Aspergillus niger GOD基因的克隆與分析

以含有Aspergillus nigerGOD基因的重組質(zhì)粒pPIC9K/GOD為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中GOD基因序列設(shè)計(jì)含SfiⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的兩端引物，采用50 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)，參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 S，52℃退火30 S，72℃延伸2 min，34個循環(huán)；72℃延伸10 min。引物序列如下：

上游引物 P1：5′-TACGGCCGTTCTGGCCAATG GCATTGAAGCCAGCCTC-3′（下劃線為SfiⅠ酶切位點(diǎn)）

下游引物 P2：5′-CGCGGATCCTTCACTGCATG GAAGCATAATCTTCC-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）

按照TaKaRa公司膠回收試劑盒中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行回收PCR產(chǎn)物。

1.6 表達(dá)載體pINA1297/GOD的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將用引物P1和P2進(jìn)行PCR得到的產(chǎn)物與pINA1297用SfiⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，用柱回收試劑盒回收目的基因，膠回收試劑盒回收載體片段，然后兩者經(jīng)T4連接酶連接過夜，連接液轉(zhuǎn)化到E.coliJM109。用含100 μg/mL氨芐霉素的LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)上海生工測序正確，得到重組載體 pINA1297/GOD。將重組載體轉(zhuǎn)化Y.lipolyticaPo1h，提取酵母DNA，PCR擴(kuò)增鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

1.7 分析方法

1.7.1 菌體生物量的測定 測定菌液在分光光度計(jì)600 nm波長處的吸光度值，即OD600。1.7.2 GOD酶活力測定 參照文獻(xiàn)[22]。

1.7.3 殘余甘油濃度測定 Nash比色法測定甘油質(zhì)量濃度[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株的構(gòu)建

將轉(zhuǎn)化后菌液涂布篩選平板YNBcasa，挑取長出的菌落，采用菌落PCR鑒定其是否為重組子，成功篩選出陽性單菌落，見圖2。

圖2 菌落PCR驗(yàn)證Fig.2 Picture of colony PCR

2.2 GOD基因在Y.lipolytica Po1h中的分泌表達(dá)

陽性轉(zhuǎn)化子在YPD平板上活化培養(yǎng)一定階段，接種到種子液體培養(yǎng)基YPD中，24 h后轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基PPB中，28℃培養(yǎng)120 h，測定GOD酶活。

轉(zhuǎn)化子發(fā)酵測酶活得到一株產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株Yarrowia lipolytica1-28，培養(yǎng)120 h后酶活達(dá)到6.4 U/mL，是野生型黑曲霉分泌所得酶活的2.8倍。利用SDS-PAGE分析重組GOD在Y.lipolytica中的表達(dá)情況，結(jié)果見圖3。重組解脂耶氏酵母產(chǎn)生的GOD與黑曲霉GOD蛋白質(zhì)的理論相對分子質(zhì)量65 600[24]接近。

2.3 碳源對菌體生長和GOD酶活的影響

按照碳源質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等的原則，將初始PPB培養(yǎng)基中的蔗糖分別替換為甘油、葡萄糖、山梨醇、乳糖、果糖和麥芽糖6種碳源以探究不同碳源種類對重組菌發(fā)酵的影響。如圖4所示，碳源替換為甘油、果糖和葡萄糖時，對重組菌的生長影響不大；而以麥芽糖、乳糖和山梨醇為碳源時，菌體量顯著降低。當(dāng)以甘油為碳源時，GOD產(chǎn)量顯著提高，達(dá)到8.2 U/mL，比對照提高了30%。而以其他原料為碳源時，酶活均降低。因此，選擇甘油作為碳源生產(chǎn)GOD。

圖3 重組菌Y.lipolytica 1-28表達(dá)GOD的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of GOD in Y.lipolytica 1-28

圖4 不同碳源對菌體生長和GOD酶活的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on cell growth and GOD production

進(jìn)一步探究甘油濃度對重組菌發(fā)酵的影響。如圖5所示，甘油質(zhì)量濃度在10~40 g/L，甘油質(zhì)量濃度的提高對菌體的生長有促進(jìn)作用；當(dāng)甘油質(zhì)量濃度在10~30 g/L之間時，GOD產(chǎn)量隨菌體量的提高而增加，可能是由于甘油量的增加促進(jìn)了菌體的生長，從而影響產(chǎn)酶；結(jié)果表明，初始甘油質(zhì)量濃度30 g/L對產(chǎn)酶的影響最好，GOD酶活最高達(dá)到10.9 U/mL；當(dāng)甘油質(zhì)量濃度高于30 g/L時，隨著甘油質(zhì)量濃度的增加，GOD酶活下降，這可能是由于過多的甘油對菌體產(chǎn)酶產(chǎn)生了抑制作用。結(jié)合菌體生長與產(chǎn)酶性能，確定甘油的初始質(zhì)量濃度為30 g/L。

2.4 氮源對菌體生長和GOD酶活的影響

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基中的氮源，將初始PPB培養(yǎng)基中的酵母提取物和氯化銨按照氮源質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等的原則替換為其它氮源。如圖6所示，菌體細(xì)胞對尿素的利用率較高，而對硝酸鉀的利用率最低，OD600值僅為10，對酵母提取物、蛋白胨、氯化銨的利用效果差異不大。結(jié)果表明，選擇酵母提取物作為單一氮源，產(chǎn)酶效果最佳，酶活達(dá)到10.3 U/mL，而蛋白胨及兩種復(fù)合氮源對GOD的產(chǎn)量影響不大，尿素、硝酸鉀和氯化銨均使產(chǎn)酶量降低。針對菌株產(chǎn)GOD能力，選擇酵母提取物作為氮源。

圖5 甘油質(zhì)量濃度對菌體生長和GOD酶活的影響Fig.5 Effects of concentration of glycerol on cell growth and GOD production

圖6 不同氮源對菌體生長和GOD酶活的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on cell growth and GOD production

2.5 無機(jī)鹽對菌體生長和GOD酶活的影響

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將培養(yǎng)基中的無水硫酸鎂分別替換為七水硫酸鋅、硫酸錳、七水硫酸亞鐵、無水氯化鈣以及四水合鉬酸銨。如圖7所示，相較于無水硫酸鎂，其它無機(jī)鹽對酵母的生長和產(chǎn)酶并沒有提高，均呈現(xiàn)下降趨勢。

2.6 pH對菌體生長和GOD酶活的影響

進(jìn)一步探究培養(yǎng)基初始pH值對重組酵母菌株發(fā)酵的影響。將培養(yǎng)基的初始pH值分別控制為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0， 進(jìn)行重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。初始pH值為6.0時，重組菌菌體量最高，OD600值達(dá)到15，酶活也達(dá)到最高，為10.1 U/mL。因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.0。

圖7 不同無機(jī)鹽對菌體生長和GOD酶活的影響Fig.7 Effects of different mineral salt growth on cell growth and GOD production

圖8 不同初始pH對菌體生長和GOD酶活的影響Fig.8 Effects of pH on cell growth and GOD production

2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇甘油、酵母提取物、氯化銨及硫酸鎂進(jìn)行四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定重組菌株的最佳發(fā)酵條件。因素與水平設(shè)計(jì)表見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Analysis of the orthogonal experimental results

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，對葡萄糖氧化酶酶活影響的主次順序?yàn)椋航湍柑崛∥铮緹o水硫酸鎂＞甘油＞氯化銨，最佳組合：甘油20 g/L、酵母膏2.64 g/L、氯化銨2.64 g/L、無水硫酸鎂0.13 g/L。

2.8 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化前后GOD酶活對比

通過以上實(shí)驗(yàn)，初步優(yōu)化得到重組菌株產(chǎn)GOD的發(fā)酵培養(yǎng)基為：甘油20 g/L，酵母膏2.64 g/L，氯化銨2.64 g/L，無水硫酸鎂0.13 g/L，磷酸二氫鉀0.32 g/L，維生素 B13.34×10-4g/L，初始 pH 值 6.0，發(fā)酵溫度28℃。優(yōu)化前后重組菌的發(fā)酵情況見圖9。優(yōu)化后GOD產(chǎn)量明顯提高，酶活達(dá)到11.0 U/mL，較優(yōu)化前GOD產(chǎn)量提高了72%。

2.9 3 L罐上GOD的發(fā)酵生產(chǎn)

前述研究了重組菌株Yarrowia lipolytica 1-28在搖瓶水平上的發(fā)酵條件優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，對3 L發(fā)酵罐上Yarrowia lipolytica 1-28生產(chǎn)GOD的發(fā)酵過程進(jìn)行了初步研究。將重組菌Y.Lipolytica 1-28以10%的接種體積分?jǐn)?shù)接種至3 L發(fā)酵罐中，當(dāng)DO反彈且大于60%時開始流加甘油以表達(dá)重組蛋白。由于甘油流加時間過長或流速過快時，產(chǎn)酶均受到抑制，因此選擇短時流加甘油，甘油流速為7.5 g/h，總共流加甘油量為20 g/L。3 L發(fā)酵罐流加甘油發(fā)酵生產(chǎn)的過程見圖10。在整個發(fā)酵過程中，菌體量顯示穩(wěn)步增加，后達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，最終達(dá)到35 g/L。發(fā)酵前期隨著菌體量的增長，溶液pH先下降至pH 3.1，隨后反彈，甘油停止流加后，pH很快上升直至8.5左右。發(fā)酵過程持續(xù)200 h，在172 h處酶活最高，達(dá)18.9 U/mL。

2.10 改進(jìn)pH控制策略

pH控制方式對產(chǎn)物的積累起著重要的作用[25]。綜合發(fā)酵情況可以看出，在pH自然變化的情況下，發(fā)酵液的pH先維持較低水平，發(fā)酵后期pH升高到較高水平，前后pH變化范圍較大。且在pH上升至5.0左右時，GOD開始快速積累。為了充分發(fā)揮解脂耶氏酵母的發(fā)酵性能，分別控制發(fā)酵液pH為4.0、5.0、6.0，在3 L罐上進(jìn)行研究。

如圖11所示，控制pH對Y.Lipolytica 1-28產(chǎn)GOD產(chǎn)生較大影響，GOD酶活得到顯著的提高。當(dāng)控制pH分別為4.0和5.0時，GOD的酶活差異不大，其最高酶活分別為57.9 U/mL和61.0 U/mL。而當(dāng)pH控制為6.0時，GOD最高酶活相對較低，為40.9 U/mL。

圖11 pH對Y.Lipolytica 1-28在3 L罐上發(fā)酵的影響Fig.11 Fermentation result of Y.Lipolytica 1-28 at a 3L bioreactor with pH control

2.11 甘油補(bǔ)料對3 L罐發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在3 L發(fā)酵罐上，用4 M NaOH和2 M H2SO4控制pH恒定為5.0，分別考察了不補(bǔ)料和甘油補(bǔ)料20 g/L（見章節(jié) 3.10）、30、40、50 g/L 的產(chǎn)酶情況。 結(jié)果如圖12所示。

在不補(bǔ)料情況下，調(diào)控發(fā)酵液pH為5.0，GOD的最高酶活為21.2 U/mL。在甘油補(bǔ)料30 g/L，發(fā)酵190 h，發(fā)酵液酶活達(dá)到最高為81.6 U/mL，與3.10中甘油補(bǔ)料為20 g/L相比，提高33.8%。甘油補(bǔ)料40 g/L和50 g/L時，甘油過剩對產(chǎn)酶產(chǎn)生了抑制作用，且產(chǎn)酶期延長，其GOD最高酶活分別為30.6 U/mL和25.9 U/mL。

圖12 甘油補(bǔ)料對Y.Lipolytica 1-28在3 L罐上發(fā)酵的影響Fig.12 Time-course of fed-batch fermentation by Glycerol feeding

3 結(jié) 語

作者構(gòu)建了分泌表達(dá)黑曲霉來源葡萄糖氧化酶的解脂耶氏酵母重組菌株，通過單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)，得到優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：甘油20 g/L，酵母膏 2.64 g/L，氯化銨 2.64 g/L，無水硫酸鎂0.13 g/L，磷酸二氫鉀 0.32 g/L，維生素 B1 3.34×10-4g/L，初始pH值6.0，28℃發(fā)酵。采用優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件培養(yǎng)重組菌株，GOD發(fā)酵酶活達(dá)到11.0 U/mL，較優(yōu)化前GOD產(chǎn)量提高了72%。在3 L發(fā)酵罐上，采用在搖瓶水平上的最優(yōu)營養(yǎng)條件，進(jìn)一步進(jìn)行了pH控制和甘油流加策略的研究。在調(diào)控pH為5.0恒定，短時流加甘油量為30 g/L時，GOD酶活可達(dá)到81.6 U/mL。綜上所述，通過pH控制策略和流加發(fā)酵策略的優(yōu)化對重組解脂耶氏酵母產(chǎn)GOD有顯著的提高，為食品安全級菌株高產(chǎn)葡萄糖氧化酶的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。