王維力 明 李 阮尚全,2 汪建紅,2

(1. 內(nèi)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，四川 內(nèi)江 641199；2. 四川省高等學(xué)校果類(lèi)廢棄物資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 內(nèi)江 641199)

中國(guó)荔枝種植主要分布在兩廣、福建、海南、四川、臺(tái)灣等地區(qū)，在食用、尤其是生產(chǎn)加工中產(chǎn)生的果皮以丟棄為主，四川合江縣栽植面積已超過(guò)2.0×104hm2，年產(chǎn)量達(dá)2.0×107kg，果皮按16%計(jì)算[1]1，可達(dá)到3.20×106kg，其深度利用意義重大。荔枝皮中黃酮含量高達(dá)17.92%[2]，在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)具有極大開(kāi)發(fā)前景[3-4]。目前荔枝皮黃酮提取方法有直接水浴加熱法[1]40-41、超聲波提取法[5]、微波與超聲波耦合[6]、酶法與超聲波耦合[7]等，鮮見(jiàn)用雙水相技術(shù)提取的研究報(bào)道。微波能顯著縮短提取時(shí)間，提高產(chǎn)率，文獻(xiàn)[8～9]用微波法和超聲波法提取同一榴蓮皮中的黃酮，微波法將提取時(shí)間由50 min縮短到120 s，產(chǎn)率由3.26%提高到4.84%。雙水相體系因條件溫和、溶劑易回收、易于連續(xù)化操作等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物、食品、制藥等領(lǐng)域，已有工業(yè)化應(yīng)用報(bào)道[10-13]。

本試驗(yàn)擬以四川合江縣荔枝皮為材料，微波和雙水相技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，用響應(yīng)曲面優(yōu)化建立提取其中黃酮的理論模型和試驗(yàn)方法，獲得各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，得到因素的最佳組合，并對(duì)提取物清除DPPH·進(jìn)行了試驗(yàn)，以期為合江荔枝皮的深度利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：T6-新世紀(jì)型，北京普析通用儀器有限公司；

離心機(jī)：TD-5型，四川蜀科儀器有限公司；

微波紫外超聲波三位一體合成萃取儀：UWave-1000型，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；

中藥粉碎機(jī)：DFT-10型，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

電子分析天平：AE240型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

蘆丁、抗壞血酸、二苯代苦味?；诫?DPPH·)、亞硝酸鈉、硝酸鋁、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀等：分析純，成都金山化學(xué)試劑廠；

試驗(yàn)用水為蒸餾水；

荔枝皮:采自于四川合江縣荔枝生產(chǎn)基地，果皮低溫烘干至恒重，粉碎備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020 0 g，以60%乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，移取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL于25 mL比色管中，根據(jù)文獻(xiàn)[7] 方法測(cè)定，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，用最小二乘法作線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)。

1.2.2 黃酮的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[7]，按式(1)計(jì)算黃酮得率。

(1)

式中：

R1——黃酮得率，%；

m1——黃酮質(zhì)量，g；

m2——荔枝皮質(zhì)量，g。

1.2.3 篩選分相鹽 根據(jù)文獻(xiàn)[14]修改如下：在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、微波時(shí)間為90 s、料液比為1∶40 (g/mL)、微波功率為250 W條件下，比較硫酸銨和磷酸氫二鉀2種分相鹽對(duì)荔枝皮中黃酮提取效果的影響。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

(1) 乙醇體積分?jǐn)?shù)：固定料液比1∶40 (g/mL)，微波功率250 W，提取時(shí)間90 s，考查乙醇體積分?jǐn)?shù) (55%，60%，65%，70%，75%)對(duì)黃酮得率的影響。

(2) 料液比：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，微波功率250 W，提取時(shí)間90 s，考查料液比[1∶20，1∶25，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)]對(duì)黃酮得率的影響。

(3) 硫酸銨用量：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶40 (g/mL)，微波功率250 W，提取時(shí)間為90s，考查硫酸銨(7.5，10.0，12.5，15.0，17.5 g/100 mL)對(duì)黃酮得率的影響。

(4) 微波輻射時(shí)間：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶40 (g/mL)，硫酸銨10 g/100 mL，微波功率250 W，考查提取時(shí)間(30，60，90，120，150 s)對(duì)黃酮得率的影響。

(5) 微波功率：固定乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶40 (g/mL)，硫酸銨10 g/100 mL，提取時(shí)間90 s，考查微波功率(200，250，300，350，400 W)對(duì)黃酮得率的影響。

1.2.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以硫酸銨用量、微波功率、微波輻射時(shí)間為試驗(yàn)因子，黃酮得率為響應(yīng)值，用 Design Expert 8.0 軟件中Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化。

1.2.6 清除DPPH·試驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[15]修改為：DPPH·濃度為0.000 2 mol/L，取提取液(黃酮濃度為0.015 g/L) 0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL于25 mL的比色管中，加入DPPH·溶液2 mL，用95%乙醇準(zhǔn)確補(bǔ)充至6 mL，搖勻，室溫下避光放置30 min，以60%乙醇作參比，在517 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值A(chǔ)i，用同法測(cè)定吸光值A(chǔ)c和Aj，考查提取液清除自由基的性質(zhì)，并與等濃度的VC和蘆丁進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。清除率計(jì)算公式：

(2)

式中：

K——DPPH·清除率，%；

Ai——加入DPPH·的待測(cè)液吸光值；

Aj——待測(cè)液吸光值；

Ac——DPPH·吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)試驗(yàn)

如圖1所示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為A=0.011 1c-0.039 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 分相鹽試驗(yàn)

在有效分相條件下，硫酸銨和磷酸氫二鉀對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果：黃酮得率分別為14.65%和11.29%，可知硫酸銨對(duì)本材料更有效，同時(shí)硫酸銨作為一種酸性鹽，具有溶解度大、易操作特點(diǎn)，適合提取黃酮類(lèi)物質(zhì)，故本試驗(yàn)確定硫酸銨為分相鹽。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響 如圖2所示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%～60%時(shí)，黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加有顯著增長(zhǎng)，65%時(shí)得率達(dá)到最高，60%～65%時(shí)得率增加不顯著；當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大時(shí)，黃酮得率有下降趨勢(shì)，可能是雜質(zhì)成分溶出競(jìng)爭(zhēng)力增強(qiáng)和對(duì)微波的作用產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致黃酮得率降低。因此確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.3.2 料液比對(duì)黃酮得率的影響 如圖3所示，料液比在1∶25～1∶50 (g/mL)時(shí)，黃酮得率隨著溶劑量的增加而增加。料液比在1∶30～1∶40 (g/mL)時(shí)增加顯著，在1∶40～1∶50 (g/mL)時(shí)增加較小，考慮到提取劑用量較大時(shí)，不僅增加了乙醇用量，增大了后續(xù)工序難度，還會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加，綜合考慮選定1∶40 (g/mL)為最佳料液比。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮得率的影響

圖3 料液比對(duì)黃酮得率的影響

2.3.3 硫酸銨用量對(duì)黃酮得率的影響 如圖4所示，黃酮得率隨硫酸銨用量的增加先增加后減少，在硫酸銨用量為10 g/100 mL 時(shí)有最大值，但隨著硫酸銨用量增加黃酮量減少，且10 g/100 mL時(shí)已出現(xiàn)少許的鹽剩余，分相明顯，綜合考慮，選取硫酸銨用量為10 g/100 mL時(shí)最佳條件。

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響 如圖5所示，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮得率先增加后減少，在90 s時(shí)有最佳值，之后有減少。可能是最初微波提取時(shí)，黃酮溶出起主導(dǎo)作用，但加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，微波對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)中有效成分結(jié)構(gòu)破壞及降解逐漸凸顯，從而導(dǎo)致得率降低。因此確定最佳提取時(shí)間為90 s。

圖4 硫酸銨用量對(duì)黃酮得率的影響

圖5 微波輻射時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

2.3.5 微波功率對(duì)黃酮得率的影響 如圖6所示，最初黃酮得率隨著微波功率的增加而增加，在250 W時(shí)有最佳值。因?yàn)槲⒉üβ试酱螅肿舆\(yùn)動(dòng)越劇烈，提取效率相對(duì)會(huì)越高，當(dāng)微波功率過(guò)大時(shí)，活性分子運(yùn)動(dòng)過(guò)于劇烈，也加劇了活性物質(zhì)間發(fā)生副作用，導(dǎo)致黃酮得率下降。另一方面也會(huì)加劇黃酮有效成分結(jié)構(gòu)被破壞及其他雜質(zhì)增加而不利于提取。故將250 W作為最佳功率。

圖6 微波功率對(duì)黃酮得率的影響

2.4 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 因素水平及編碼 見(jiàn)表1。

2.4.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比為1∶40 (g/mL)，以硫酸銨用量、微波功率、微波時(shí)間為變量因子，黃酮得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

通過(guò) Design Expert 8.0 軟件對(duì)17組數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及擬合，得回歸方程為：

R1=-12.842+3.514 5A+0.150 8B+0.145 3C-0.000 4AB+0.011 667AC-0.000 25BC-0.569A2-0.000 235 6B2-0.000 676 667C2。

(3)

表1 Box-Behnken 中心組合因素水平編碼表

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸模型方差分析結(jié)果?

2.4.3 黃酮得率的響應(yīng)面分析 試驗(yàn)因子 A、B、C 所構(gòu)成的響應(yīng)曲面圖如圖7～9所示。

從響應(yīng)曲面圖可形象地看出圖形均為山丘形曲面，有極大值，結(jié)合方差分析，可以得出微波功率在交互作用中對(duì)黃酮得率的影響最顯著，微波時(shí)間的影響次之，硫酸銨用量的影響作用不夠顯著。利用 RMS 預(yù)測(cè)，通過(guò)對(duì)各個(gè)響應(yīng)面最高點(diǎn)的極值分析及對(duì)最高點(diǎn)取值，并對(duì)多元二次回歸方程進(jìn)行求解，得出各個(gè)因子的解，最優(yōu)工藝條件為：硫酸銨用量9.85 g/100 mL，微波時(shí)間91.79 s，微波功率268.03 W，在此條件下荔枝皮中黃酮得率的理論值可達(dá)20.947 8%。

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 考慮到可操作性，以硫酸銨用量為10 g/100 mL、微波時(shí)間為90 s、微波功率為270 W驗(yàn)證 Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)所得結(jié)果的可靠性，5次平行實(shí)驗(yàn)所得黃酮得率的統(tǒng)計(jì)均值為20.74%，與此條件下理論預(yù)測(cè)值20.94% 的相對(duì)誤差為0.97%，表明該優(yōu)化參數(shù)可靠，試驗(yàn)?zāi)Ｐ陀兄笇?dǎo)意義。

圖7 因素A和因素B對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)面

Figure 7 Response surface plot about effects of factor A and factorB on yield of flavonoids

圖8 因素A和因素C對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)面

Figure 8 Response surface plot about effects of factor A and factor C on yield of flavonoids

圖9 因素B和因素C對(duì)黃酮得率影響的響應(yīng)面

Figure 9 Response surface plot about effects of factor B and factor C on yield of flavonoids

2.5 對(duì)DPPH·的清除效果

如圖10所示，荔枝皮黃酮對(duì)DPPH·有一定的消除能力，且隨樣品濃度的增大而增強(qiáng)，在1.5 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系，濃度達(dá)到0.25～1.50 μg/mL時(shí)，荔枝皮黃酮對(duì)DPPH·的清除作用好于VC、蘆丁。

圖10 不同清除劑的DPPH·清除率

3 結(jié)論

本研究充分利用了微波和雙水相技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，縮短了提取時(shí)間，溶劑易于回收。以Box-Behnken方法進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)，建立了微波聯(lián)用雙水相提取荔枝皮中黃酮的試驗(yàn)理論模型，得到的工藝參數(shù)為硫酸銨用量10 g/100 mL，微波時(shí)間90 s，微波功率270 W，黃酮得率為20.74%；提取物有較好的清除DPPH·的能力，存在較好的量效關(guān)系。后續(xù)將對(duì)黃酮的分離純化及應(yīng)用作進(jìn)一步的研究。