柴家樂(lè) 白雪蓮 鄭雙芝 盧甜甜 李曉菡 陳怡怡 吳丹丹

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310016)

海綿具有特殊的濾食系統(tǒng)，可以使外界菌種在其體內(nèi)和體表富集，成為共生真菌。海綿共生菌種屬?gòu)?fù)雜，種類多樣[1-2]。海綿共生真菌長(zhǎng)期生活在宿主體內(nèi)的特殊環(huán)境中，并與宿主協(xié)同進(jìn)化，在演化過(guò)程中二者形成了互惠共生的關(guān)系，因此可能產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物[3-4]。國(guó)內(nèi)外對(duì)植物共生真菌的研究報(bào)道[5-6]較多，例如已利用紫杉共生真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇，該物質(zhì)為良好的抗腫瘤藥物。但是對(duì)動(dòng)物共生真菌的研究[7-8]相對(duì)較少，關(guān)于海綿的就更少。孟慶鵬[9]曾對(duì)海綿菌中可培養(yǎng)的共附生微生物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在4種海綿中有85株共生細(xì)菌，并對(duì)其功能基因進(jìn)行了篩選，但未對(duì)其共生真菌進(jìn)行研究。吳琦等[10]對(duì)南海海綿共生真菌Emericellav variecolor XSA-07-2的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及活性進(jìn)行研究，采用色譜分離技術(shù)共鑒定出14個(gè)新化合物，體外生物活性篩選試驗(yàn)表明，部分多烯α吡喃酮衍生物表現(xiàn)出抗流感病毒和抗腫瘤活性。Sou 等[11]純化獲得48種海綿相關(guān)微生物，測(cè)定了各品種液體培養(yǎng)的乙酸乙酯提取物的細(xì)胞毒性、溶血活性和蝦的致死活性。

近年來(lái)，致瀉大腸埃希氏菌引起的食源性疾病日益受到人們的關(guān)注，其引發(fā)的出血性腸炎的暴發(fā)或散發(fā)性病例較為常見(jiàn)，每年約有2.8～4.0億例人源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染發(fā)病，約造成30～50萬(wàn)人死亡[12]。目前對(duì)大腸桿菌所引起的疾病多采用有效的抗生素進(jìn)行治療?？股氐膹V泛持續(xù)使用和不當(dāng)使用導(dǎo)致大腸桿菌耐藥株的不斷增多，使臨床對(duì)大腸桿菌病的治療變得十分困難，有時(shí)甚至找不到可治之藥。鑒于此，本課題組以日本磯海綿為試材，采用3種培養(yǎng)基通過(guò)劃線分離法進(jìn)行共生真菌的分離，利用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，以大腸桿菌為受試菌株，對(duì)分離獲得的海綿共生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性研究，以期為海綿資源的有效利用和大腸桿菌新的抑菌活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)提供新方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品的采集

日本磯海綿：采自大連星海灣，采樣后立即裝入采樣袋于4 ℃保藏運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 試劑

海水配制：將氯化鈉26.518 g、氯化鎂2.447 g、硫酸鎂3.305 g、氯化鈣1.141 g、氯化鉀0.725 g、碳酸氫鈉0.202 g、溴化鈉0.083 g分別溶解至蒸餾水中，混合，定容至1 000 mL[13]；

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖肉湯固體培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)、馬丁培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(BYP)；

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli1.2812)：中國(guó)微生物菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將冷凍保藏的樣品進(jìn)行自然解凍，去除雜質(zhì)，用無(wú)菌水對(duì)海綿表面進(jìn)行反復(fù)清洗3～5次。將最后1次清洗液涂布于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察是否長(zhǎng)菌，如未長(zhǎng)菌即可開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 日本磯海綿共生真菌分離 用無(wú)菌剪將海綿組織剪成小塊，置于100 mL無(wú)菌水中充分震蕩，靜置5 min，吸取200 μL上述溶液分別涂布于PDA培養(yǎng)基(蒸餾水配制)、PDA培養(yǎng)基(海水配制)、馬丁培養(yǎng)基(海水配制)上，靜置，使溶液滲入培養(yǎng)基中，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況。待形成明顯菌落的時(shí)候，利用劃線分離法進(jìn)行分離，直至獲得單一菌種。

1.2.3 共生真菌形態(tài)學(xué)觀察

(1) 菌落形態(tài)觀察：將分離得到的菌種，采用點(diǎn)植法接種于其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)。每天觀察和記錄菌落生長(zhǎng)狀況，拍攝菌落圖片。

(2) 共生真菌顯微形態(tài)觀察：將菌株通過(guò)劃線分離法接種于培養(yǎng)基上，垂直于劃線方向，用無(wú)菌鑷子將滅菌后的蓋玻片斜插入培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿于28 ℃恒溫培養(yǎng)，直至菌絲長(zhǎng)至蓋玻片約1/2處，取出蓋玻片，放在滴有無(wú)菌水的載玻片上，觀察磯海綿共生真菌的顯微形態(tài)。

1.2.4 共生真菌分子生物學(xué)鑒定 將分離的純菌種送至上海桑尼生物有限公司進(jìn)行rDNA ITS測(cè)序，首先提取DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見(jiàn)表2，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性：95 ℃，5 min；變性：95 ℃，30 s；退火：58 ℃，30 s；延伸：72 ℃，1 min；終延伸：72 ℃，7 min；循環(huán)數(shù)：35。反應(yīng)完成后，取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。確認(rèn)PCR擴(kuò)增片段。取各個(gè)菌種純化后的PCR產(chǎn)物，使用測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序。最后進(jìn)行序列分析，利用BLAST搜索軟件將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)真菌菌株的序列進(jìn)行比對(duì)，獲得相似性序列，再用DNAMA9.0軟件進(jìn)行鄰接法(Neighbor Joining)聚類系統(tǒng)發(fā)育分析，從而確定菌種的分類地位。

表1 引物設(shè)計(jì)

表2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

結(jié)合菌落形態(tài)、顯微形態(tài)、分子鑒定結(jié)果，參照文獻(xiàn)[14]確定菌株的分類學(xué)地位。

1.2.5 共生真菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性研究

(1) 共生真菌代謝產(chǎn)物制備：將各菌株接種于2 L與其對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，28 ℃，100 r/min條件下，恒溫培養(yǎng)7～14 d。發(fā)酵液離心(8 000 r/min，10 min)，收集上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，將乙酸乙酯合并后減壓濃縮至干，稱重，用二甲基亞砜(DMSO)溶解備用。

(2) 抑菌活性測(cè)定：以大腸埃希氏菌為測(cè)試菌株，用BYP培養(yǎng)液在37 ℃恒溫?fù)u床上培養(yǎng)3 d。采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，當(dāng)菌懸液中細(xì)菌濃度為1×105個(gè)/mL時(shí)采用96孔板微量法測(cè)定抑菌活性。試驗(yàn)組每孔加入90 μL菌懸液(1×105個(gè)/mL)，加入10 μL代謝產(chǎn)物溶液(DMSO為溶劑，按照3.5.1制備)，5孔為一組，做2組平行。以DMSO為陰性對(duì)照，以100 mmol/L青霉素溶液為陽(yáng)性對(duì)照。加樣完成后，在37 ℃，100 r/min條件下，置于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。以12 h作為一個(gè)測(cè)定周期，在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。按式(1)計(jì)算抑制率。

(1)

式中：

c——抑制率，%；

OD1——陰性對(duì)照組吸光值；

OD2——試驗(yàn)組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以3個(gè)獨(dú)立樣本的x±SEM表示。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后，用Student’s t檢驗(yàn)進(jìn)行2組之間的比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 日本磯海綿共生真菌的分離與鑒定

從日本磯海綿中共分離到33株共生真菌，其中采用PDA培養(yǎng)基(蒸餾水)分離到21株，PDA培養(yǎng)基(海水)分離到7株，馬丁培養(yǎng)基(海水)分離到5株。通過(guò)對(duì)各菌種的菌落形態(tài)觀察、顯微形態(tài)觀察以及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果分析可知，磯海綿共生真菌分別屬于4個(gè)屬：青霉屬、曲霉屬、絲衣霉屬、紅酵母屬。其中L18、L19屬于青霉屬，P7屬于紅酵母屬，L2、L15未能確定其菌種分類地位。具體情況如表3所示。

由表4可知，青霉屬和曲霉屬的真菌是海綿共生菌的優(yōu)勢(shì)菌，二者分離頻率之和達(dá)87.9%，其中M1呈現(xiàn)典型的青霉菌的菌落形態(tài)特征，菌落呈綠色，生長(zhǎng)速度快，菌落致密，與L9菌落形態(tài)相似，但菌落背面呈橙色，具體種屬還需進(jìn)一步鑒定。M4等8株菌為曲霉屬，菌絲向空中不斷伸長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度也較快，有些呈黃色，有些呈白色。海綿共生真菌種類多，具有微生物多樣性的特點(diǎn)。典型海綿共生真菌菌落圖片和顯微形態(tài)見(jiàn)圖1、2。

表3 不同培養(yǎng)基共生真菌分離情況

2.2 分子生物學(xué)鑒定及聚類分析

將共生真菌測(cè)序結(jié)果輸入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，將有最高比對(duì)度的菌株及匹配編號(hào)列于表5中。共生真菌序列與比對(duì)后獲得相似度較高的菌株序列，錄入DNAMA9.0軟件進(jìn)行聚類分析，采用鄰接法(Neighbor Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，共生真菌分為4個(gè)屬：青霉屬、曲霉屬、酵母屬、絲衣霉屬。據(jù)菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)特征及聚類分析可知，L1是桔青霉，M3是雜色曲霉。其中L2、L15、L18、L19、P7與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的菌種的序列同源性<50%，不能確定其種屬。

表4 共生真菌形態(tài)特征

圖1 部分共生真菌菌落形態(tài)特征

圖2 部分共生真菌顯微形態(tài)(放大倍數(shù)均為400倍)

2.3 共生真菌的抑菌活性

采用96孔板法測(cè)定各菌株代謝產(chǎn)物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)L2、L7、M1、M3、M4、P7對(duì)于大腸埃希氏菌表現(xiàn)出一定的抑制效果(見(jiàn)表6)。

從表6可知，33株海綿共生真菌中有7株具有抑菌活性。本試驗(yàn)以12 h為檢測(cè)周期，培養(yǎng)24 h后有7株共生真菌次生代謝產(chǎn)物有一定的抑菌活性，其中M3對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，抑制率達(dá)(56.66±2.28)%，其次是M1，抑制率為(51.23±6.24)%，二者均高于陽(yáng)性對(duì)照。共生真菌M4的抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，48 h達(dá)最強(qiáng)，為(41.69±6.33)%。其它菌抑菌活性未呈時(shí)間依賴性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)共分離獲得33株海綿共生真菌，分子鑒定結(jié)合形態(tài)觀察確定青霉屬和曲霉屬真菌為海綿共生真菌的優(yōu)勢(shì)菌。

表5 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)匹配結(jié)果

表6 各菌種次生代謝產(chǎn)物對(duì)大腸埃希氏菌的抑制效果?

? “-”表示無(wú)抑制作用；同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

其中L1是桔青霉，M3是雜色曲霉。針對(duì)大腸埃希氏菌進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，M3等7株共生真菌代謝產(chǎn)物抑菌活性強(qiáng)，具有良好的研究潛質(zhì)。今后還將利用色譜技術(shù)分離和鑒定其化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)，為開(kāi)發(fā)新的抑菌活性物質(zhì)提供新化合物。此外，試驗(yàn)共分離獲得33株海綿共生真菌，菌株數(shù)量有限，后續(xù)試驗(yàn)還可以通過(guò)增加分離培養(yǎng)基種類等方法，進(jìn)一步挖掘海綿共生真菌資源。